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2005-07-28Dissertation DOI: 10.18452/15284
Kristallstrukturanalyse des kohlenhydratbindenden Moduls 27-1 der Beta-Mannanase 26 aus Caldicellulosiruptor saccharolyticus im Komplex mit Mannohexaose und Kristallisation der ATPase HP0525 aus Helicobacter pylori
dc.contributor.authorRoske, Yvette
dc.date.accessioned2017-06-18T06:56:06Z
dc.date.available2017-06-18T06:56:06Z
dc.date.created2005-08-05
dc.date.issued2005-07-28
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/15936
dc.description.abstractKohlenhydrat-bindende Module (CBMs) sind die bekanntesten nicht-katalytischen Module, die mit Enzymen assoziiert sind, welche die pflanzliche Zellwand hydrolysieren. Die beta-Mannanase 26 von Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Stamm Rt8B.4, ist eine thermostabile modulare Glycosidhydrolase, die N-terminal zwei dicht aufeinander folgende nicht-katalytische kohlenhydratbindende Module besitzt. Diese spezifisch beta-Mannan bindenden CBMs wurden kürzlich als Mitglieder der CBM-Familie 27 klassifiziert. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Kristallisation und Strukturanalyse des ersten kohlenhydratbindenden Moduls der ß-Mannanase aus C. saccharolyticus (CsCBM27-1) mit einer gebundenen Mannohexaose und in ligandfreier Form beschrieben. Grundlage für diese Arbeit waren Daten aus der isothermen Titrationskalorimetrie zur Quantifizierung der Affinität von CsCBM27-1 für lösliche Mannooligosaccharide. Die hier präsentierte hochaufgelöste Kristallstruktur des ungebundenen und Mannohexaose gebundenen CsCBM27-1 erlaubt weitere Einblicke in die Interaktion ß-Mannan bindender CBMs mit ihren entsprechenden Liganden. CsCBM27-1 zeigt eine typische ß-sandwich jellyroll-Struktur mit gebundenen Kalziumion. Die Mannohexaosebindung wird durch drei dem Lösungsmittel zugängliche Tryptophanreste und einige direkte Wasserstoffbrückenbindungen vermittelt. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Reinigung und Kristallisation der ATPase Virb11 HP0525 aus Helicobacter pylori. Das native Protein HP0525 ließ sich gut rekombinant herstellen und reinigen. Es wurde aus einer von mehreren Kristallisationsbedingungen durch Optimierung der Kristallisationskomponenten ausreichend große Kristalle erhalten, die gute Diffraktionseigenschaften zeigten. Neben dem nativen Protein wurde Selenomethionin-substituiertes Protein synthetisiert und gereinigt. Von diesem Protein SeMet-HP0525, resultierten hexagonale Kristalle. Zur Derivat-Datensatzsammlung ist es aufgrund der Publikation der Kristallstruktur dieser hexameren ATPase HP0525 nicht mehr gekommen. Weitere strukturelle Untersuchungen an diesem Protein wurden als nicht mehr erforderlich angesehen.ger
dc.description.abstractCarbohydrate-binding modules (CBMs) are the most common non-catalytic modules associated with enzymes active in plant cell-wall hydrolysis. Caldicellulosiruptor saccharolyticus strain Rt8B.4 Man26 is a thermostable modular glycoside hydrolase beta-mannanase which contains two non-catalytic modules in tandem at its N-terminus. These modules were recently shown to function primarily as ß-mannan-binding modules and have accordingly been classified as members of a novel family of CBMs, family 27. In the first part of this study, the crystallization and crystal structure analysis of the first carbohydrate binding module (CsCBM27-1) of the beta-mannanase from C. saccharolyticus in native and mannohexaose-bound form is described. The basis for this study were data from isothermal titration calorimetry for quantifying the binding affinity of CsCBM27-1 for soluble mannooligosaccharidesBoth structures permit further insights into the interaction of beta-mannan binding CBMs with their corresponding ligands. CsCBM27-1 shows the typical beta-sandwich jellyroll fold observed in other CBMs with a single calcium ion bound opposite to the ligand binding site. This arrangement is similar to topologies of other CBM families. The crystal structures reveal that the overall fold of CsCBM27-1 remains virtually unchanged upon sugar binding and that binding is mediated by three solvent-exposed tryptophan residues and few direct hydrogen bonds. The second part of this study addressed the purification and crystallization of the VirB11 ATPase HP0525 of Helicobacter pylori. The native HP0525 protein was produced in recombinant Escherichia coli and purified for crystallization. One of several crystallization experiments yielded large crystals by optimization of the concentration of the crystallization components. The crystals revealed good diffraction behavior. In addition to the native protein, selenomethionine-substituted HP0525 was produced and purified. Hexagonal crystals were obtained from the SeMet-HP0525. No derivative datasets were collected, because the crystal structure of the hexameric ATPase HP0525 was published by Yeo et al. (2000). Further structural investigations for the protein HP0525 were judged unnecessary.eng
dc.language.isoger
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité
dc.rights.urihttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
dc.subjectKristallstrukturger
dc.subjectKohlenhydrat-bindende Moduleger
dc.subjectMannooligosaccharideger
dc.subjectThermodynamikger
dc.subjectSuperfamilieger
dc.subjectCarbohydrate-binding moduleeng
dc.subjectMannooligosaccharideseng
dc.subjectCrystal structureeng
dc.subjectThermodynamicseng
dc.subjectSuperfamilyeng
dc.subject.ddc610 Medizin und Gesundheit
dc.titleKristallstrukturanalyse des kohlenhydratbindenden Moduls 27-1 der Beta-Mannanase 26 aus Caldicellulosiruptor saccharolyticus im Komplex mit Mannohexaose und Kristallisation der ATPase HP0525 aus Helicobacter pylori
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-10043685
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/15284
dc.identifier.alephidHU001358792
dc.date.accepted2004-12-13
dc.contributor.refereeSeckler, Robert
dc.contributor.refereeHeinemann, Udo
dc.contributor.refereeHöhne, Wolfgang
dc.subject.dnb33 Medizin
dc.subject.rvkUQ 5600
dc.subject.rvkYC 5204
dc.subject.rvkYC 5214
dc.subject.rvkWD 5365
local.edoc.pages101
local.edoc.type-nameDissertation
local.edoc.institutionMedizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité

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