Untersuchung des Einflusses mitochondrialer Polymorphismen auf die phänotypische Ausprägung der Neurofibromatose Typ 1 bei monozygoten Zwillingen

Abstract

Einleitung: Die Entdeckung somatischer homoplasmischer Mutationen der mitochondrialen DNA (mtDNA) in Tumoren gab Anlass zu der Frage, ob Mutationen der mtDNA einen Einfluss auf Entstehung und Wachstum von Tumoren haben könnten. Die Neurofibromatose Typ 1 (NF1, von Recklinghausen) ist eine der häufigsten erblichen Tumorerkrankungen mit einer Penetranz von 100%, aber hoher phänotypischer Variabilität. Selbst eineiige Zwillinge können sich erheblich in ihrem Phänotyp unterscheiden. Durch die ungleiche Verteilung der Mitochondriengenome auf die Embryonen könnten heteroplasmische mtDNA-Polymorphismen den Phänotyp der Neurofibromatose Typ 1 unterschiedlich beeinflussen. Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, ob es interindividuelle Unterschiede in der mtDNA-Sequenz monozygoter Zwillinge gibt, die an Neurofibromatose Typ 1 erkrankt sind, sich jedoch im Phänotyp unterscheiden. Des Weiteren habe ich nach intraindividuellen Unterschieden der mtDNA-Sequenz zwischen Blut und Tumorgewebe gesucht. Die Frage war, ob es somatische mtDNA-Mutationen gibt, die einen Einfluss auf das Entstehen der Tumore haben könnten. Innerhalb der mtDNA gibt es hypervariable Regionen (HVR), von denen der oft in heteroplamischer Form vorkommende D310-Trakt im D-loop als Marker für klonales Wachstum in Tumoren empfohlen wurde. Ich habe versucht, durch Analyse des D-loops der mtDNA aus Neurofibromen klonales Wachstum nachzuweisen. Methoden: Ich habe die mitochondriale DNA vier monozygoter Zwillingspaare untersucht. Die DNA wurde sowohl aus Blutleukozyten als auch aus Neurofibromen extrahiert. Ich habe zunächst mit mtDNA-spezifischen Primern eine Long-range PCR durchgeführt. Mit dem Long-range PCR-Produkt als Matrize habe ich in 17 verschachtelten PCR Reaktionen Fragmente generiert und diese sequenziert. Den relativen Anteil heteroplasmischer Längenvarianten des D310-Traktes ermittelte ich mittels Genotypisierung. Ergebnisse: Beim Vergleich der mtDNA-Sequenzen mit der mtDNA Standardsequenz (Genbank, NC_001807) habe ich insgesamt 88 Abweichungen gefunden. Die meisten waren in der Datenbank Mitomap verzeichnet. Es fanden sich keine interindividuellen Unterschiede innerhalb der einzelnen Paare. Beim Vergleich der mtDNA-Sequenzen aus Blut- mit denen aus Tumorzellen eines Zwillingspaares fand ich keinen intraindividuellen Unterschied. Der D310-Trakt innerhalb der HVR2 kam bei allen Zwillingspaaren in heteroplasmischer Form vor. Bei den Zwillingen A1 und A2 sowie deren Mutter MA konnte ich annähernd die gleiche Verteilung der Löngenvarianten in Blutzellen sowie in Neurofibromen von A1 und A2 zeigen. Schlussfolgerungen: Ich konnte keinen Hinweis dafür finden, dass Veränderungen in der mtDNA die phänotypische Ausprägung der NF1 beeinflussen. In Neurofibromen konnte ich durch Untersuchung des D310-Traktes keinen Hinweis auf klonales Wachstum finden.

Introduction: The discovery of homoplasmic somatic mutations of the mitochondrial DNA (mtDNA) led to the question whether mutations of mtDNA could influence tumor development and growth. Neurofibromatosis Type 1 (NF1) is one of the most common inherited disorders. Penetrance of the disease is 100%, but phenotypic variability is high, even amongst identical twins. I wanted to test the hypothesis, whether the unequal distribution of heteroplasmic mtDNA variants between the embryos might influence NF1 phenotype. The aim of this study was to look for interindividual differences of the mtDNA sequence between identical twins. In order to detect somatic mutation that could possibly influence tumor development I searched for intraindividual differences between blood- and tumor-mtDNA. The hypervariable D310-tract within the D-loop is heteroplasmic in most individuals, but shows a tendency towards homoplasmy in tumors. Therefore, it has been proposed as marker for clonal tumor growth. I tried to identify clonal growth in cutaneous neurofibromas by examination of the D310-tract. Methods: I examined the mtDNA from four pairs of identical twins. MtDNA was extracted from blood-leucocytes as well as from neurofibromas. With DNA-specific primers I first performed a long-range PCR. The product was then reamplified as 17 nested PCR fragments and sequenced afterwards. The relative amount of heteroplasmic D310-tract length variants was analyzed by genotyping. Results: Taken together, I identified 88 deviations from the mtDNA standard sequence (Genbank NC_001807). Most of these variants were already known as polymorphisms in the database MITOMAP. I could neither find any interindividual differences between the individuals of a twin pair nor intraindividual differences between blood- and tumor-mtDNA. The D310-tract was heteroplasmic in all twin pairs. Twins A1 and A2 as well as their mother showed almost the same distribution of length variants in blood and tumor. Conclusion: I could not show that mtDNA polymorphisms play a role in phenotypic variability of NF1. Examination of the D310 tract in cutaneous neurofibromas did not show signs of clonal growth.