Regulation der Stabilität der proangiogenen Transkriptionsfaktoren c-Jun, Id1 und Id3 durch das COP9-Signalosom

Abstract

Für die Progression des Wachstums maligner Tumoren und ihre Metastasierung ist die Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden, eine essentielle Voraussetzung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die proangiogenen Transkriptionsfaktoren c-Jun, Id1 und Id3 in ihrer Stabilität gegenüber dem Ubiquitin/26S-Proteasom-System durch das COP9-Signalosom (CSN) kontrolliert werden. Dieses bildet einen multimeren Proteinkomplex, der deutliche Homologien mit dem Lid-Subkomplex des 26S-Proteasoms aufweist. Sowohl c-Jun als auch Id3 binden an die Untereinheit CSN5. Id3 interagiert zusätzlich mit CSN7. Rekombinantes c-Jun, ein bekanntes Substrat der CSN-assoziierten Kinasen CK2 und PKD, wird durch Curcumin, einen Hemmstoff dieser Kinasen, deutlich destabilisiert. Daneben induziert Curcumin hochmolekulare Formen von c-Jun, bei denen es sich höchstwahrscheinlich um Ubiquitin-Konjugate handelt. Ferner beschleunigt Curcumin, ebenso wie die CK2- und PKD-Inhibitoren Emdodin, DRB und Resveratrol, in HeLa-Zellen den proteasomalen Abbau von c-Jun. Die c-Jun-abhängige Produktion von VEGF wird durch alle vier Kinase-Hemmstoffe signifikant reduziert. Verstärkt wird dieser Effekt noch durch den proteasomalen Inhibitor MG-132. Id3 wird nicht von den CSN-assoziierten Kinasen phosphoryliert. Allerdings hemmt es in einem Kinase-Assay die Phosphorylierung von c-Jun, ICSBP und CSN2. Curcumin und Emodin regen in HeLa-Zellen die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von Id3 an. Die Proteolyse von Id1 wird in HeLa-Zellen ebenfalls in Anwesenheit dieser beiden Hemmstoffe stimuliert. Mittels Kotransfektion von Id3 und His-markiertem Ubiquitin konnte eine verstärkte Ubiquitinierung von Id3 in Gegenwart von Curcumin direkt nachgewiesen werden. Außerdem wird Id3 durch die Überexpression von CSN2 stabilisiert. Auf diesen Daten basiert die Schlussfolgerung, dass die CSN-abhängige Phosphorylierung den Abbau von c-Jun und der beiden Id-Proteine über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System inhibiert und dadurch ein interessantes neues Ziel einer antiangiogenen Tumortherapie repräsentiert.

Angiogenesis, the formation of new blood vessels from the existing vasculature, is a prerequisite for the progression of solid tumor growth and metastasis. In this study it is shown that the COP9 signalosome (CSN) regulates the stability of the angiogenic transcription factors c-Jun, Id1 and Id3 towards the ubiquitin/26S proteasome system. The COP9 signalosome constitutes a multimeric protein complex that shares sequence homology with the 26S proteasome lid complex. Both c-Jun and Id3 physically interact with the CSN subunit CSN5. In addition, Id3 can bind to CSN7. Recombinant c-Jun, a substrate of the CSN-associated kinases CK2 und PKD, is destabilized by curcumin, an inhibitor of these two kinases. Furthermore, curcumin induces high molecular weight c-Jun species, most likely ubiquitin conjugates. All tested inhibitors of the CK2 and PKD, emodin, DRB, resveratrol, as well as curcumin accelerate the degradation of c-Jun by the 26S proteasome in HeLa cells. The c-Jun-dependent expression of VEGF, the most potent angiogenic factor, is significantly reduced by the four kinase inhibitors. MG-132, an inhibitor of the 26S proteasome, also diminishes the production of VEGF. Id3 is not phosphorylated by the CSN-associated kinases. However, it inhibits c-Jun, ICSBP and CSN2 phosphorylation. Curcumin and emodin significantly induce ubiquitination and proteasome-dependent degradation of Id3 in HeLa cells. Proteasome-dependent degradation Id1 in HeLa cells is also stimulated by treatment with curcumin or emodin. Ubiquitination of Id3 is shown directly by cotransfection of HeLa cells with Id3 and His-tagged ubiquitin. Curcumin increases Id3-ubiquitin conjugate formation. In addition, overexpression of CSN2 leads to stabilization of Id3 protein. On the basis of these data it is concluded that CSN-mediated phosphorylation inhibits ubiquitination and proteasome-dependent degradation of c-Jun, Id1 and Id3. The COP9 signalosome thus represents an interesting new target for antiangiogenic tumor therapy.