Nachweis von Aspergillus-fumigatus-Infektionen aus dem Respirationstrakt mittels TaqMan-PCR

Abstract

Die invasive Aspergillose (IA) wird mehr und mehr zu einem lebensbedrohlichen Problem bei immunsupprimierten Patienten. Der Hauptverursacher der IA ist der Aspergillus fumigatus. Es existieren verschiedene DNS-Extraktions-Methoden und PCR Assays, um Aspergillus fumigatus DNS in Bronchiallavagen (BAL) nachzuweisen. Häufig sind diese Methoden langwierig und verdeutlichen den Bedarf an einer klinisch relevanten Methode, mit der der Aspergillus-fumigatus-DNS Nachweis schnell und zuverlässig erbracht werden kann. Wir haben eine schnelle Methode entwickelt, mit der wir quantitative Ergebnisse innerhalb sechs Stunden erhalten können. Es wurde ein Extraktionsverfahren auf mechanischer Basis (FastPrep), in Kombination mit einer real-time-PCR, basierend auf der TaqMan- Technologie, etabliert. Dazu wurde eine Aspergillus-fumigatus-spezifischeSonde entwickelt und ein Aspergillus-fumigatus-spezifisches Primerpaar eingesetzt. Durch den Einsatz einer Standardreihe wurden die Ergebnisse quantifiziert. Es wurden hauptsächlich Bronchiallavagen sowie andere Materialien von 204 Patienten untersucht. Die Patienten wurden hinsichtlich ihres Verdachtes an einer IA erkrankt zu sein, anhand bestimmter Kriterien (EORTC) in bestimmte Gruppen eingeteilt. Die Ergebnisse wurden innerhalb der einzelnen Gruppen analysiert. Bei allen 8 Patienten mit bewiesener IA gelang der Nachweis von Aspergillus-fumigatus-DNS. In dieser Gruppe konnten quantitativ die höchsten Werte gemessen werden. Des Weiteren konnte eine Rückläufigkeit der Werte mit abnehmendem Aspergillose-Verdacht, sowie nach erfolgter antimykotischer Therapie beobachtet werden. Die diagnostische Sensitivität der Methode beträgt 81,3%, die Spezifität liegt bei 93,7%. Der positive prädiktive Wert ist 72,2%, der negative prädiktive Wert beträgt 96,1%. Als zusätzlicher Baustein in einer umfangreichen Gesamtdiagnostik, kann diese Methode einen Beitrag zur Verbesserung molekularer Nachweisverfahren leisten.

Invasive aspergillosis (IA), often caused by Aspergillus fumigatus, is an important cause of death of immunocompromised patients. Several DNA-extraction methods and PCR assays are available for detecting Aspergillus fumigatus DNA in bronchoalveolar lavage (BAL) samples of patients with invasive aspergillosis. These methods are often time consuming and emphasize the need to develop a clinical relevant rapid DNA isolation assay that gives reliable results in a short time. We have developed a new and rapid method which yields results within six hours.This was achieved by combining high-speed cell disruption using a mechanical extraction procedure (FastPrep), with a real-time PCR assay based on TaqMan technology.A newly designed Aspergillus-fumigatus-specific probe and Aspergillus-fumigatus-specific primers were established. This combination also produces quantitative results by comparing the results with a DNA serial dilution used in the real-time PCR. BAL fluids and other material from 204 patients were analyzed. According to the risk for an IA, the patients were devided in different groups, using specific criteria published by the EORTC. The results were related to these groups. For all 8 patients with proven IA, the detection of Aspergillus-fumigatus-DNA succeeded. In this group, the highest amount of Aspergillus-fumigatus-DNA was detected. A decraesing quantitiy of Aspergillus-fumigatus-DNA could be detected after antifungal treatment and connected with the decreasing suspicion of an IA in the other groups. The diagnostic sensitivity of this method is 81,3%, the specifity is 93,7%. The positive predictive value is 72,2%, the negative predicitive value 96,1%. Adjunctive use of these method may be helpful in the diagnosis of IA.