Entwicklung einer Proteasomen-basierten Polyepitop-Plasmid-Vakzine am Beispiel des Tumor-assoziierten Antigens MUC1

Abstract

Peptide aus intrazellulären Pathogenen sowie Tumorantigene aus mutierten oder überexprimierten Proteinen werden MHC I-restringiert auf der Oberfläche von Mammaliazellen präsentiert und dabei von cytotoxischen T-Lymphozyten erkannt. Die Peptidgenerierung erfolgt vorwiegend durch das Ubiquitin/26S Proteasomensystem, das eine zentrale Rolle bei der antitumoralen Immunantwort spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Polyepitopvakzine in Form von Plasmid-DNA entwickelt und auf ihre Effizienz untersucht. Als Modellantigen diente MUC1, ein von verschiedenen Adenokarzinomen und hämatologischen Tumoren überexprimiertes Glykoprotein. Ein aus dem MUC1-Protein bekanntes HLA-A2.1-abhängiges Epitop wurde als Polyepitop in verschiedenen Variationen synthetisiert, einer 20S proteasomalen in vitro Degradation unterzogen und seine Verdauprodukte massenspektrometrisch analysiert. Als optimale Sequenz für die Prozessierung des Polyepitops in die gewünschten Einzelepitope erwies sich deren einfache Verknüpfung ohne intervenierende Sequenzen. Zur Untersuchung des Effekts einer Ubiquitinfusion auf die Stabilität des MUC1-Polyepitops wurden anschließend verschiedene Strategien der linearen Fusion von Ubiquitin an das Polyepitop innerhalb eines Plasmids getestet. Durch transiente Transfektion der Plasmide konnte die Stabilität ihrer Translationsprodukte mittels Immunoblotanalysen quantifiziert werden. Die Ergebnisse demonstrieren, daß das Polyepitop durch die N-terminale Fusion von Wildtyp-Ubiquitin am effizientesten degradiert wird, wobei eine Polyubiquitinierung nicht stattzufinden scheint. Die Auswertung der folgenden in vitro Cytotoxizitätsassays sowie der Immunisierungsstudien wurde durch die schwache Affinität des gewählten subdominanten MUC1-Epitops zum HLA-A2.1-Komplex beeinträchtigt. Die vorliegende Arbeit unterstreicht die Bedeutung einer umfassenden Analyse intra- und extrazellulärer Vorgänge bei der Entwicklung einer Plasmidvakzine unter Verwendung subdominanter Epitope.

Peptides from intracellular pathogens as well as tumor antigens from mutated or overexpressed proteins are presented in an MHC class I restricted manner on the surface of mammalian cells and are thereby recognized by cytotoxic T lymphocytes. Peptide generation is mainly carried out by the ubiquitin/26S proteasome system which plays a crucial role in the antitumor immune response. In the present study, a polyepitope vaccine was generated in the form of plasmid DNA and analyzed for its efficiency. As model antigen MUC1, a glycoprotein overexpressed in various adenocarcinomas and hematological tumors, was used. A known HLA-A2.1 restricted epitope from the MUC1 protein was synthesized as a polyepitope in different variations, subjected to a 20S proteasomal in vitro degradation, and its digestion products were analyzed by means of mass spectrometry. The optimal sequence for the processing of the polyepitope into the desired single epitopes was shown to be their simple conjunction without spacer sequences. Different strategies of linear fusion of ubiquitin to the polyepitope within a plasmid were subsequently tested to analyze the effect of ubiquitin fusion on the stability of the MUC1 polyepitope. After transient transfection of the plasmids, the stability of their translation products was quantified by means of immunoblot analyses. The results demonstrate that the polyepitope is degraded most efficiently through N-terminal fusion of wild type ubiquitin, while a polyubiquitination does not seem to occur. The evaluation of the subsequent in vitro cytotoxicity assays and immunization studies was impaired by the low affinity of the selected subdominant MUC1 epitope to the HLA-A2.1 complex. The present study emphasizes the importance of an extensive analysis of intra- and extracellular processes when generating a plasmid vaccine using subdominant epitopes.