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2007-12-14Dissertation DOI: 10.18452/15694
Funktionelle Untersuchungen von Ahnak durch Protein-Protein-Wechselwirkungen und in Ahnak-Defizienzmodellen
dc.contributor.authorPetzhold, Daria
dc.date.accessioned2017-06-18T08:28:25Z
dc.date.available2017-06-18T08:28:25Z
dc.date.created2008-02-01
dc.date.issued2007-12-14
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/16346
dc.description.abstractAhnak ist ein ubiquitäres Protein, das an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt ist. In der Herzmuskelzelle ist Ahnak überwiegend am Sarkolemma lokalisiert und bindet an Aktin und an die regulatorischen Beta2-Untereinheit des L-Typ-Kalzium-Kanals. Das Ziel dieser Arbeit war die Funktion von Ahnak im Herzen mit Hilfe eines Knock-out-Maus-Modells und in Bindungsstudien zu untersuchen. Morphologische Untersuchungen zeigten, dass das Längenwachstum adulter Kardiomyozyten bei Ahnakdefizienz signifikant reduziert war. Die Kontraktionseigenschaften adulter isolierter Ahnak-defizienter Kardio-myozyten (im Alter von 6 Monaten) waren ebenfalls verändert. Die Kontraktions- und Relaxaktionsgeschwindigkeiten waren erhöht. Eine Erhöhung des diastolischen Kalzium-Spiegels zeigten die Kardiomyozyten schon im Alter von 3 Monaten. Diese beobachteten phänotypischen Veränderungen lassen vermuten, dass die Aktivität des L-Typ-Kalzium-Kanals erhöht ist. In dieser Arbeit konnte das PXXP-Motiv, in der C-terminalen Ahnak-Domäne, als die hochaffine Beta2-Bindungsstelle (KD ~ 60 nM) identifiziert werden. Substitution von Prolin gegen Alanin verringerte zwar die Bindung zur Beta2-Untereinheit dramatisch (KD ~ 1 µM), hob sie aber nicht auf. In weiteren Bindungsstudien zeigte sich, dass die natürlich vorkommende Missensmutation I5236T die Bindung zur regulatorischen Beta2-Untereinheit verstärkte, dagegen verminderte die PKA-abhängige Phosphorylierung der beiden Proteinpartner die Bindung. Experimente am ganzen isoliert perfundierten Herzen zeigten, dass Ahnak-Knock-Out-Herzen geringer Beta-adrenerg stimulierbar waren. Ahnak scheint wie eine physiologische Bremse des kardialen Kalzium-Kanals zu wirken.ger
dc.description.abstractAhnak is an ubiquitous protein with in unique structure, which has been implicated in cell type specific functions. In cardiomyocytes, ahnak is predominantly localized at the sarcolemma and is associated with actin and with the regulatory beta2 subunit of the L-type calcium-channel. The aim of this work was to unravel the function of ahnak in the heart, using a knock-out-mouse model and binding studies. Morphological studies showed a significant decrease in the cell-length of ahnak deficient cardiomyocytes. The contractile parameters of isolated adult ahnak deficient cardiomyocytes (in the age of 6 month) were altered. The development of tension and relaxation were increased. An increase of diastolic calcium was already observed at the age of 3 month. In general the observed phenotypic changes suggested an increased activity of the L-type calcium-channel. In this study, a PXXP-motif, which locates in ahnaks C-terminus, was identified as the high affinity beta2 subunit binding site (KD ~ 60 nM). Substitution of both proline residues by alanine reduced, but did not abolish the binding (KD ~ 1 µM). Further binding studies revealed that the natural occurring ahnak missense mutation I5236T increases the binding affinity to the regulatory beta2 subunit. By contrast PKA dependant phosphorylation of both protein partners decreases the interaction. In studies with isolated perfused working heart preparations, the ahnak deficient hearts were less beta-adrenergic stimulated than hearts from wild type. Taken together ahnak seems to be a physiological brake of the cardiac calcium-channel.eng
dc.language.isoger
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
dc.subjectAhnakger
dc.subjectAhnak-Knock-Out-Mausger
dc.subjectBeta-adrenerge Stimulierungger
dc.subjectBeta2 Untereinheitger
dc.subjectKalzium-Transientger
dc.subjectelektromechanische Kopplungger
dc.subjectKardiomyozytenger
dc.subjectL-Typ-Kalzium-Kanalger
dc.subjectMissensmutationenger
dc.subjectProteinbindungenger
dc.subjectPXXP-Motivger
dc.subjectPKA-abhängige Phosphorylierungger
dc.subjectahnakeng
dc.subjectahnak-knock-out-mouseeng
dc.subjectbeta-adrenergic stimulationeng
dc.subjectbeta2 subuniteng
dc.subjectcalcium-transienteng
dc.subjectexcitation-contraction-couplingeng
dc.subjectcardiomyocyteeng
dc.subjectL-type-calcium-channeleng
dc.subjectmissense mutationeng
dc.subjectprotein bindingeng
dc.subjectPXXP-motifeng
dc.subjectPKA-dependant phosphorylationeng
dc.subject.ddc570 Biowissenschaften, Biologie
dc.titleFunktionelle Untersuchungen von Ahnak durch Protein-Protein-Wechselwirkungen und in Ahnak-Defizienzmodellen
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-10083943
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-100212084
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-100212096
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/15694
dc.identifier.alephidHU003103233
dc.date.accepted2007-07-31
dc.contributor.refereeHerrmann, Andreas
dc.contributor.refereeMorano, Ingo
dc.contributor.refereeRegitz-Zagrosek, Vera
dc.subject.dnb32 Biologie
dc.subject.rvkWW 4120
dc.subject.rvkWW 7700
local.edoc.type-nameDissertation
local.edoc.institutionMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I

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