Reinigung und Charakterisierung einer lysosomalen Phospholipase A1 aus Makrophagen

Abstract

Makrophagen sind professionelle phagozytische Zellen, welche körpereigene gealterte oder toten Zellen und in den Körper eingedrungene Krankheitserreger aufnehmen. Die phagozytierten Partikel werden von lysosomalen Hydrolasen abgebaut und daraus hervorgehende Antigene an Zellen des spezifischen Immunsystems präsentiert. Aufgabe der lysosomalen Phospholipase A1 (PLA1) ist der Abbau von Phospholipiden. Sie spielt damit nicht nur eine elementare Rolle bei dem Abbau von Phospholipidmembranen nach Phago- und Autophagozytose, sondern kann auch an der Generation von Lipidantigenen beteiligt sein. Die vorliegende Arbeit bietet zum ersten Mal Hinweise auf die Sequenz der lysosomalen PLA1. Mittels proteinbiochemischer Reinigung und nachfolgender massenspektrometrischer Sequenzanalyse wurden zwei Proteinkandidaten identifiziert, welche der lysosomalen PLA1-Aktivität zugrunde liegen können. Des Weiteren werden ausführliche Untersuchungen zu den Katalyseeigenschaften des Enzyms an Liposomen präsentiert. Die Lipidzusammensetzung der Membran beeinflusst maßgeblich die Aktivität der lysosomalen PLA1. So haben in die Membran integrierte anionische Phospholipide eine stark enzymaktivierende Wirkung. Eine Erhöhung der Ionenstärke oder des pH-Wertes vermindern die Bindungsfähigkeit der lysosomalen PLA1 an die Membran und damit deren Aktivität. Dies lässt vermuten, dass elektrostatische Wechselwirkungen eine Rolle bei der Membranbindung spielen. Das Enzym besitzt pIs

Macrophages are professional phagocytes which engulf and degrade senescent and dead cells as well as pathogens. Phagocytosed particles are subsequently degraded by lysosomal enzymes. The lysosomal phospholipase A1 (PLA1) degrades phospholipids, the major components of biological membranes and, hence, plays a mandatory role in decomposition of phagocytosed and autophagocytosed membranes. Furthermore the enzyme might play a role in the processing of lipid antigens for immune presentation. Nevertheless, the gene encoding this important enzyme activity is as yet unknown. Here, we used proteinbiochemical methods to isolate the lysosomal PLA1 activity from RAW B cells and identified resulting sequences by tandem mass spectrometry. This analysis revealed for the first time two putative protein candidates responsible for lysosomal PLA1 activity. Using native enzyme fractions and liposome-embedded substrate, we show that PLA1 activity depends on the presence of anionic phospholipids, low pH and low ionic strength. Lysosomal PLA1 only attaches to membranes with anionic but not zwitterionic charges. High ionic strength impairs binding demonstrating that electrostatic attraction is responsible for membrane partitioning. Upon binding the enzyme remains on membranes for numerous catalytic cycles. The enzyme’s pIs at