Identification and characterization of peptide-like MHC-ligand exchange catalyst as immune response enhancer

Abstract

MHC Klasse II Moleküle präsentieren Peptidantigene für die Überwachung durch CD4+ T Zellen an der Zelloberfläche. Um Sicherzustellen, dass diese Peptidliganden möglichst genau die intrazelluläre Proteinzusammensetzung widerspiegeln, hat sich im Verlauf der Evolution ein komplexer Prozessierungsweg entwickelt, welcher möglichst stabile Peptid/MHC Komplexe an die Zelloberfläche liefert. MHC Moleküle, welche ihren Liganden verloren haben, konvertieren zudem spontan in einen ‚nichtrezeptiven’ Zustand, was als zusätzlicher Sicherheitsmechanismus dient. Diese Studie zeigt jedoch, dass Aminosäureseitenketten kurzer Peptide diesen Sicherheitsmechanismus umgehen können indem sie katalytisch einen reversiblen Ligandenaustausch auslösen. Die katalytische Aktivität von Dipeptiden, wie z.B. Tyr-Arg (YR), war dabei stereospezifisch und konnte durch zusätzliche Modifikationen verstärkt werden, welche das konservierte H-Brückennetzwerk der so genannten P1-Tasche des MHC Moleküls adressierten. Die Dipeptide verstärkten dabei sowohl die Antigenbeladung als auch den Ligandenaustausch, wobei deren relative Aktivität genau mit den bekanten Ankerpräferenzen der P1 Tasche korrelierte. Letzteres weist somit auf eine direkte Interaktion der katalytischen Seitenkette des Dipeptides mit dieser Tasche hin. Der Verstärkungseffekt war auch in CD4+ T Zellassays zu beobachten, bei denen der alleleselektive Einfluss der Dipeptide direkt in eine deutliche Erhöhung der Sensitivität der antigenspezifischen T Zellantwort führte. Durch weitere molekulardynamische Berechnungen konnte die Hypothese unterstützt werden, dass die Besetzung der P1 Tasche durch Aminosäureseitenketten einen Kollaps der leeren Bindungstasche zum ‚nichtrezeptiven’ Zustand verhindert. Während der Antigenpräsentation könnte P1 somit unmittelbar als ‚Sensor’ für die Beladung mit Peptiden dienen. Diese Annahme konnte experimentell durch spektroskopische Untersuchungen unter Verwendung des ANS-Farbstoffes (8-Anilino-1-Naphtalensulfonsäure) sowie durch Messung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz bestätigt werden. Darüber hinaus konnten konformationsspezifische Antikörper, welche bislang lediglich mit unbeladenen MHC Molekülen in Verbindung gebracht wurden, hier als spezifische Sonden für den nichtrezeptiven Zustand definiert werden. Als mögliche Risikofaktoren könnten katalytische kurze Peptide eine Rolle bei der Auslösung von Autoimmunerkrankungen spielen. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass sie die Beladung von Glutenantigenen auf das Zöliakie-assozierte HLA-DQ2 Molekül verstärken können. Zumindest in vitro konnte ihre Anwesenheit deshalb auch die antigenspezifische Antwort von CD4+ T Zellen verstärken, welche zuvor von Zöliakiepatienten isoliert worden waren. Auf der einen Seite könnten diese Peptide als ‚MHC-loading enhancer’ (MLE) deshalb als mögliche Risikofaktoren die Ausbildung entzündlicher (Auto-) Immunerkrankungen beschleunigen. Auf der anderen Seite könnten sie jedoch auch als ‚drug-like’ Vakzinadditiv zur Verbesserung von Immuntherapien führen.

MHC class II molecules present antigenic peptides on the cell surface for the surveillance by CD4+ T cells. To ensure that these ligands accurately reflect the content of the intracellular MHC loading compartment, a complex processing pathway has evolved that delivers only stable peptide/MHC complexes to the surface. As additional safeguard mechanism, MHC molecules quickly acquire a ‘non-receptive’ state once they have lost their ligand. This study shows that amino acid side chains of short peptides can bypass these safety mechanisms by triggering the reversible ligand-exchange. The catalytic activity of dipeptides such as Tyr-Arg (YR) is stereo-specific and could be enhanced by modifications addressing the conserved H-bond network near the P1 pocket of the MHC molecule. It enhanced both antigen-loading and ligand-release and strictly correlated with reported anchor preferences of P1, the specific target site for the catalytic side chain of the dipeptide. The effect was evident also in CD4+ T cell assays, where the allele-selective influence of the dipeptides translated into increased sensitivities of the antigen-specific immune response. The hypothesis that occupation of P1 prevents the ‘closure’ of the ‘empty’ peptide binding site into the ‘non-receptive’ state was further supported by molecular dynamic calculations. During antigen processing and presentation P1 may therefore function as important ‘sensor’ for peptide-load. Spectroscopic studies using ANS dye (8-aninilino-1-napthalenesulfonic acid) and intrinsic tryptophan fluorescence data, confirm the postulate by providing direct evidence for the conformational transitions. Moreover conformation specific antibodies previously described to be specific for ‘empty’ MHC could be shown to be a ‘probe’ for ‘receptive conformation’. As potent risk factors short peptides may be involved in the induction of autoimmune diseases. It could be shown here that they could enhance the loading of gluten derived antigen on celiac disease linked-HLA-DQ2 allele. At least in vitro the effect could enhance gluten specific CD4+ T cell response on T cell clones obtained from celiac disease patients. Thus, on one hand short peptides might work as ‘MHC loading enhancer’ (MLE) in the precipitation of inflammatory-‘autoimmune’ disorder, on the other hand they might be used as drug like vaccine ‘additive’ in various therapeutic settings.