Deciphering the function of G protein-coupled receptor 30

Abstract

Der G Protein-gekoppelte Rezeptor 30 (GPR30) wurde vornehmlich im Kontext von schnellen Östrogeneffekten auf zelluläre Signaltransduktionskaskaden untersucht und stellt möglicherweise einen neuen Östrogenrezeptor dar. Die physiologische Funktion von GPR30 in vivo konnte jedoch bisher nicht ermittelt werden. Daher wurde in dieser Arbeit ein Gpr30-defizientes Mausmodell charakterisiert, bei dem ein Teil der kodierenden Sequenz durch einen LacZ-Reporter ersetzt wurde (Gpr30-lacZ). Die Integration des Konstruktes in den Gpr30-Locus wurde mittels Southern blotting und Real-time PCR verifiziert. Gpr30-positive Zelltypen wurden durch Kolokalisation von LacZ mit zelltyp-spezifischen Markerproteinen identifiziert. Weitere Versuche dienten der Aufklärung des Phänotyps von Gpr30-lacZ Mäusen. Zur Identifizierung von Proteinen des GPR30-Signalkomplexes wurden Yeast-Two-Hybrid Analysen mit der N- bzw. C-terminalen Domäne des Rezeptors durchgeführt. Die wesentlichen LacZ-positiven Zellpopulationen waren (i) Endothelzellen in kleinen arteriellen Gefäßen, (ii) glatte Muskelzellen, Perizyten und neuronale Subpopulationen im Gehirn, (iii) Hauptzellen in der Magenschleimhaut, (iv) Zellpopulationen in der Adenohypophyse und dem Hypophysenzwischenlappen sowie (vi) chromaffine Zellen im Nebennierenmark. Während der Phenotypisierung des Mausmodells wurde eine Reduktion der CD62L+ T-Zellen von ca. 50% im peripheren Blut festgestellt. Mittels Yeast Two-Hybrid Analyse wurden Pals1-associated tight junction protein (PATJ) und FUN14 domain-containing 2 (FUNDC2) als mögliche Interaktionspartner identifiziert. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine zelluläre Basis für die Funktion von Gpr30 in vivo ermittelt. Der Phänotyp in Gpr30-lacZ Mäusen ist wahrscheinlich durch eine verringerte Produktion von naiven T-Zellen im Thymus bedingt. PATJ bindet die C-terminalen Aminosäuren von GPR30 mit einer PDZ-Domäne und könnte ein Gerüst-protein des GPR30-Signal¬komplexes darstellen.

The orphan G protein coupled receptor 30 (GPR30) was predominantly analyzed in the context of membrane-initiated estrogen signaling suggesting that GPR30 represents a novel estrogen receptor. However, the physiological function of GPR30 in vivo remained unknown. To unravel the physiological role of murine Gpr30 in vivo, a Gpr30-deficient mouse model was analyzed that harbors a LacZ reporter (Gpr30-lacZ) within the Gpr30 locus. The targeting of Gpr30 was verified by Southern blotting and real-time PCR. Gpr30-expressing cell types were identified by colocalization of LacZ along with cell type-specific markers. Further experiments aimed to decipher the phenotype of Gpr30-lacZ mice. To gain information about the signaling complex of human GPR30, yeast two-hybrid screenings were performed with the N- and C-terminal domains as bait. The main LacZ-positive cell populations were (i) endothelial cells in small arterial vessels of various tissues, (ii) smooth muscle cells, pericytes, and neuronal subpopulations in the brain, (iii) gastric chief cells in the stomach, (iv) cells in the intermediate and anterior pituitary, and (v) chromaffin cells in the adrenal glands. Extensive phenotype screening at the German Mouse Clinic revealed reduced numbers of T cells in the peripheral blood of Gpr30-lacZ mice. Especially the proportion of CD62L+ cells was decreased by approx. 50%. Yeast two-hybrid screening led to the identification of Pals1-associated tight junction protein (PATJ) and FUN14 domain-containing 2 (FUNDC2). In conclusion, this study provides a cellular basis for the function of Gpr30 in vivo. Since CD62L+ cells represent the naive T cell compartment, the phenotype of Gpr30-lacZ mice suggests an impaired production of T cells in the thymus. PATJ likely binds the C-terminus of GPR30 with one of its PDZ domains and may represent a scaffolding protein of the GPR30 signaling complex.