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2011-02-25Dissertation DOI: 10.18452/16275
Regulation der Enzymaktivität der Restriktionsendonuklease EcoRII durch Autoinhibition
dc.contributor.authorSzczepek, Michal
dc.date.accessioned2017-06-18T10:34:45Z
dc.date.available2017-06-18T10:34:45Z
dc.date.created2011-02-28
dc.date.issued2011-02-25
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/16927
dc.description.abstractDNA-Restriktions und -Modifikationssysteme sind in Prokaryoten weit verbreitet und stellen einen wirksamen Schutz gegen das Eindringen mobiler genetischer Elemente dar. Sie kodieren für eine Restriktionsendonuklease (REase) und eine DNA-Methyltransferase (MTase) gleicher Nukleotidsequenz Spezifität. Die MTase methyliert die zelluläre DNA und schützt sie durch diesen epigenetischen Marker vor der Wirkung der REase. Die REase verhindert die Aufnahme fremder, unmethylierter DNA durch sequenzspezifische Spaltung. EcoRII ist eine REase, die für die effiziente DNA-Spaltung mindestens zwei Kopien ihrer Erkennungssequenz benötigt. Untersuchungen der EcoRII-Struktur und -Funktion offenbarten, dass das Protein aus zwei stabilen Domänen aufgebaut ist, wobei die N-terminale Domäne wie ein Repressor die C-terminale Domäne sterisch blockiert und deren katalytische Aktivität verhindert. Dieser als Autoinhibition bezeichnete und von eukaryotischen Proteinen gut bekannter Regulationsmechanismus wurde erstmals für eine REase vorgeschlagen. In dieser Arbeit konnten wir die Regulation der EcoRII-Enzymaktivität durch Autoinhibition auf molekularer Ebene beweisen. Wir identifizierten ß-Strang 1 (B1: 18YFVYIKR24) und a-Helix 2 (H2: 26SANDT30) als essenzielle inhibitorische Elemente der N-terminalen Domäne des EcoRII-Moleküls. Die Deletion von B1 oder H2 führte zu einer vollständigen Aufhebung der Autoinhibition. Darüber hinaus ist es uns gelungen, die 3D-Röntgenkristallstruktur von EcoRII mit 1,9 Å zu lösen und mit Hilfe von Computermodellen neue Interaktionen des Enzyms mit der DNA „minor groove“ zu beschreiben sowie eine Mg2+-Bindungstasche zu charakterisieren. Die Untersuchung der EcoRII-MTase durch limitierte Proteolyse zeigte, dass das Enzym in Abhängigkeit von der DNA-Sequenz und von seinen Kofaktoren, DNA auf unterschiedliche Weise binden kann. Kristallisierungsversuche der EcoRII-MTase in Anwesenheit der hemi-methylierten DNA-Erkennungssequenz ergaben erste diffraktierende Kristalle, deren Qualität optimiert werden muss und zur Strukturlösung führen soll.ger
dc.description.abstractRestriction and modification systems are wide spread among prokaryotes and pre-sent an efficient protection against invasion of mobile genetic elements. In general, they code for a restriction endonuclease (REase) and a DNA-methyltransferase (MTase) of the same DNA specificity. The MTase methylates the cellular DNA and by this epigenetic marker protects it against the action of the REase. The REase pre-vents the entry of foreign unmethylated DNA by site-specific cleavage. EcoRII is an REase which needs at least two copies of the recognition sequence for efficient cleavage. Investigations of the EcoRII structure and function revealed that the pro-tein is composed of two stable domains: the N-terminal domain acts as a repressor by sterically blocking the C-terminal domain and thereby inhibiting its catalytic activity. This regulatory mechanism is known as autoinhibition and has been often described for eukaryotic proteins, but for the first time was proposed for a REase. In this work, we verified the regulation of the EcoRII enzyme activity by autoinhibition at the molecular level. We identified ß-strand 1 (B1: 18YFVYIKR24) and a-helix 2 (H2: 26SANDT30) as essential inhibitory elements of the N-terminal domain. Deletion of B1 or H2 caused a complete abolishment of the autoinhibition. Fur-thermore, we were able to solve the 3D-X-ray crystal structure of EcoRII at 1.9 Å. Based on computer modelling we discovered new interactions between EcoRII and the DNA minor groove and defined the position of the Mg2+ binding pocket. Investigations of the EcoRII MTase by limited proteolysis showed that the enzyme binds DNA depending on DNA sequence and cofactors in different manners. Crystallography experiments with EcoRII MTase in the presence of hemimethylated recognition site DNA showed for the first time diffracting crystals which need further optimisation to create high quality crystals which allow structure solution.eng
dc.language.isoger
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
dc.rightsNamensnennung
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/
dc.subjectKristallstrukturger
dc.subjectAutoinhibitionger
dc.subjectEcoRIIger
dc.subjectMethyltransferaseger
dc.subjectRestriktions-endonukleaseger
dc.subjectcrystal structureeng
dc.subjectautoinhibitioneng
dc.subjectEcoRIIeng
dc.subjectmethyltransferaseeng
dc.subjectrestriction enzymeeng
dc.subject.ddc570 Biowissenschaften, Biologie
dc.titleRegulation der Enzymaktivität der Restriktionsendonuklease EcoRII durch Autoinhibition
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-100182213
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/16275
dc.identifier.alephidBV037251818
dc.date.accepted2011-02-17
dc.contributor.refereeKrüger, Detlev H .
dc.contributor.refereeSpahn, Christian
dc.contributor.refereeFriedhoff, Peter
dc.subject.dnb32 Biologie
dc.subject.rvkWG 4050
local.edoc.pages93
local.edoc.type-nameDissertation
local.edoc.institutionMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I

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