Regulation und Funktion von Ubiquitin-ähnlichen Proteinen im Rahmen der zellulären Immunantwort

Abstract

Infektionen lösen eine Immunantwort aus, welche u.a. durch Induktion von Interferonen (IFN) für die Expression von antibakteriell oder antiviral wirkenden Proteinen sorgt. Eines der am stärksten induzierten Gene nach Typ I IFN Stimulation ist das Interferon stimulated gene 15 (ISG15). ISG15 gehört zu den Ubiquitin-ähnlichen Proteinen und wird über eine Enzymkaskade kovalent an zu modifizierende Proteine konjugiert. Sowohl freiem ISG15, als auch ISG15-Konjugaten wurden antivirale Funktionen nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation von ISG15, der ISGylierung und der an der ISGylierung beteiligten Enzyme vergleichend nach Typ I und Typ II IFN Stimulation untersucht. In HeLa Zellen zeigte sich, dass ISG15 und ISG15-Konjugate sowohl nach Typ I, als auch nach Typ II IFN Stimulation gebildet werden. Die Unterschiede in der Menge der ISGylierten Proteine konnten in Zusammenhang mit der unterschiedlich starken Expression der an der ISGylierung beteiligten Enzyme gebracht werden. Durch Inhibition der Expression der einzelnen Enzyme wurde weiterhin nachgewiesen, dass nach Typ I und Typ II IFN Stimulation das gleiche E2-Enzym (UBE2L6), aber unterschiedliche E3-Ligasen an der ISGylierung beteiligt sind. Während die ISGylierung nach Typ I IFN Stimulation größtenteils von der E3-Ligase Herc5 abhängt, zeigte sich, dass nach Typ II IFN Stimulation weitere noch nicht identifizierte ISG15 E3-Ligasen an dem Prozess beteiligt sind. Microarry- und siRNA-Analysen führten zur Identifizierung der potentiellen ISG15 E3-Ligasen UBE3A und ARIH1. Dabei zeigte sich, dass UBE3A nach Typ I und ARIH1 nach Typ II IFN Stimulation einen Einfluss auf die ISGylierung von Proteinen haben. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass in HeLa Zellen Typ I und Typ II Interferone die ISGylierung induzieren, wobei sich die Enzymkaskade zwischen den Interferonen auf Ebene der E3-Ligasen unterscheidet. Diese Ergebnisse geben neue Einblicke in die Regulation der IFN vermittelten ISGylierung.

Infections initiate the induction of an immune response that lead to induction of interferons followed by expression of antibacterial and antiviral proteins. One of the most upregulated genes after type I interferon (IFN) stimulation is the Interferon stimulated gene 15 (ISG15). ISG15 belongs to the family of ubiquitin-like modifiers and is covalently attached to target proteins via an enzyme cascade. It was shown that free ISG15 as well as ISG15-conjugates exhibit antiviral functions. In this thesis the regulation of ISG15, ISGylation and the involvement of enzymes after type I and type II IFN treatment were analysed. It could be demonstrated that ISG15 and ISG15-conjugates are generated after type I as well as type II IFN treatment in HeLa cells. Differences in the amount of ISGylated proteins were shown to correlate with the expression of proteins of the enzyme cascade. Inhibition of these enzymes demonstrated that the E2-enzyme UBE2L6 is involved in the ISGylation process after both types of IFN stimulation, whereas different E3-ligases are implicated in ISGylation of proteins after type I and type II IFN stimulation. It could be shown that the E3-ligase Herc5 is involved in type I IFN mediated ISGylation, whereas other not yet identified ISG15 E3-ligases are involved in type II IFN mediated ISGylation. Microarry- and siRNA-assays led to the identification of the putative ISG15 E3-ligases UBE3A and ARIH1, whereas UBE3A had an influence on type I IFN mediated ISGylation and ARIH1 affected the type II IFN mediated ISGylation. In this thesis it could be demonstrated that both types of interferons are able to induce ISGylation in HeLa cells, but different E3 ligases are involved in conjugation of ISG15 to its target proteins after type I and type II IFN induction. These observations give new insights into the regulation of IFN mediated ISGylation.