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2012-02-15Dissertation DOI: 10.18452/16467
Der Einfluss eines neuartigen Fe-S Clusters auf die O2-Toleranz der membrangebundenen Hydrogenase aus Ralstonia eutropha
dc.contributor.authorGoris, Tobias
dc.date.accessioned2017-06-18T11:16:59Z
dc.date.available2017-06-18T11:16:59Z
dc.date.created2012-02-24
dc.date.issued2012-02-15
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/17119
dc.description.abstractHydrogenasen sind essentielle Enzyme im mikrobiellen H2-Kreislauf und werden als vielversprechende Katalysatoren in biologisch basierten H2-Technologien angesehen. Ein entscheidender Nachteil vieler Hydrogenasen ist ihre hohe O2-Sensitivität. Die membrangebundene Hydrogenase (MBH) aus Ralstonia eutropha ist eines der wenigen Beispiele für Hydrogenasen, die in Gegenwart von O2 katalytisch aktiv sind. Die molekularen Ursachen dieser O2 Toleranz sind bislang ungeklärt. In bisherigen Studien wurde lediglich das [NiFe]-Zentrum und dessen Umgebung auf Faktoren untersucht, die die O2-Toleranz des Enzyms hervorrufen könnten. In dieser Arbeit wurde daher der Fokus auf die kleine Untereinheit der MBH gelegt, in der sich drei elektronentransferierende Fe-S Cluster befinden. Die ligandierenden Aminosäuren dieser Fe-S Cluster wurden mittels ortsspezifischer Mutagenese verändert und die resultierenden MBH-Varianten physiologisch, biochemisch, spektroskopisch und elektrochemisch charakterisiert. Dabei wurde gezeigt, dass die O2-Toleranz der MBH maßgeblich auf einer Modifikation eines dieser drei Fe-S Cluster beruht. In der direkten Umgebung des zum aktiven Zentrum nächstgelegenen Fe-S Clusters befinden sich sechs statt vier Cysteine, wie in O2 sensitiven [NiFe]-Hydrogenasen. Die beiden zusätzlichen Cysteine um dieses proximale Cluster wurden gegen Glycine ausgetauscht, die an der entsprechenden Position in O2-sensitiven Hydrogenasen zu finden sind. Der Austausch der zusätzlichen Cysteine führte in vivo und in vitro zu einer erhöhten O2 Sensitivität der MBH. In EPR-spektroskopischen Untersuchungen wurde beobachtet, dass diese MBH-Variante veränderte elektronische Eigenschaften aufweist. Statt des für O2-tolerante Hydrogenasen typischen EPR-Spektrums wurde ein Signal detektiert, welches in O2-sensitiven Hydrogenasen zu finden ist. Anhand der Ergebnisse wurde ein Modell erstellt, das erklärt, wie eine modifizierte Fe-S Clusterkette zur O2-Toleranz von Hydrogenasen beiträgt.ger
dc.description.abstractHydrogenases are essential for H2 cycling in microbial metabolism and serve as valuable blueprints for H2-based biotechnological application. Like many metalloproteins, most hydrogenases are extremely oxygen-sensitive and prone to inactivation by even traces of O2. The O2-tolerant membrane-bound [NiFe]-hydrogenase of Ralstonia eutropha is one of the few examples that have established a mechanism enabling H2 uptake in the presence of ambient O2. The molecular mechanisms of this O2 tolerance are not yet unravelled. However, up to date, only the large subunit harbouring the [NiFe] active site has been in the focus of studies on O2 tolerance. In the present study, the role of the small subunit with its electron relay, consisting of three Fe-S clusters, was investigated. Amino acid residues involved in coordination of all three clusters were exchanged, and the resulting MBH variants were investigated with physiological, biochemical, electrochemical and spectroscopic methods. It is shown that the rare feature of O2 tolerance is crucially related to a modification of the electron transfer chain. The Fe-S cluster proximal to the catalytic centre is surrounded by six instead of the four conserved coordinating cysteines. Removal of the two additional cysteines renders the protein O2-sensitive in vivo and in vitro. Electron paramagnetic resonance spectroscopy of this MBH variant revealed a signal resembling the spectrum usually detected in O2-sensitive [NiFe]-hydrogenases. The data imply that the major mechanism of O2 tolerance is based on the reductive removal of oxygenic species guided by the unique architecture of the electron transport chain rather than a restricted access of O2 to the active site.eng
dc.language.isoger
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
dc.rightsNamensnennung - Keine kommerzielle Nutzung
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/de/
dc.subjectWasserstoffger
dc.subjectHydrogenaseger
dc.subjectEisen-Schwefel-Clusterger
dc.subjectRalstonia eutrophager
dc.subjectSauerstofftoleranzger
dc.subjectHydrogenaseeng
dc.subjectHydrogeneng
dc.subjectiron sulfur clustereng
dc.subjectoxygen toleranceeng
dc.subjectRalstonia eutrophaeng
dc.subject.ddc570 Biologie
dc.titleDer Einfluss eines neuartigen Fe-S Clusters auf die O2-Toleranz der membrangebundenen Hydrogenase aus Ralstonia eutropha
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-100199597
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/16467
dc.identifier.alephidBV039911755
dc.date.accepted2011-09-27
dc.contributor.refereeFriedrich, Bärbel
dc.contributor.refereeDobbek, Holger
dc.contributor.refereeLubitz, Wolfgang
dc.subject.dnb32 Biologie
dc.subject.rvkWD 5055
local.edoc.pages202
local.edoc.type-nameDissertation
bua.departmentMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I

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