DNA-katalysierte Acyltransferreaktionen

Abstract

In dieser Arbeit wurde geprüft, ob eine sequenzspezifische Hybridisierung von zwei Peptid-PNA-Konjugaten an einem komplementären DNA-Templat die Bildung eines neuen Peptids auslösen kann, welches proapoptotische Eigenschaften besitzt. Dazu binden zwei kurze PNA-Oligomere an einem komplementären DNA-Templat und ermöglichen dadurch den Transfer einer Aminoacylgruppe. In den vorgestellten Untersuchungen trug ein Oligomer einen Alaninrest, welcher C-terminal als Thioester gebunden war. An das zweite PNA-Oligomer war ein Peptid mit N-terminalem Cysteinrest geknüpft. Mittels einer Cystein-vermittelten Transferreaktion wurde die Aminoacyleinheit auf das Akzeptor-Konjugat übertragen und es entstand das freie PNA-Oligomer sowie ein neues Peptid. Die so generierten Peptid-PNA-Konjugate waren so konstruiert, dass sie an BIR3 binden und damit dessen Interaktion mit Caspase-9, einem Schlüsselenzym der Apoptose, entgegenwirken konnten. Es wurde ein Assay entwickelt, bei dem die DNA-gesteuerte Transferreaktion mit der Aktivierung der Caspase-9 aus dem inhibitorischen Komplex mit BIR3 in HEK293-Zelllysat kombiniert wurde. Als Vorbereitung für eine intrazelluläre Anwendung der Nukleinsäuretemplat-katalysierten Peptidsynthese wurde zunächst die Stabilität der Konjugate in Zelllysat untersucht und weiterhin eine Synthesestrategie zur PEGylierung der verwendeten Peptid-PNA-Konjugate entwickelt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass mit dem DNA-gesteuerten Aminoacyltransfer zum ersten Mal eine Methode aufgezeigt wurde, welche die in Nukleinsäuren kodierte Information für die Generierung eines Wirkstoffes nutzt, der die Aktivität eines Proteins kontrollieren kann. Die Synthese des aktiven Peptidwirkstoffes gelang in der komplexen Umgebung von Zelllysat, erfolgte sequenzspezifisch und in Gegenwart substöchiometrischer Konzentrationen des Templats.

In this thesis it was investigated, whether the sequence specific hybridisation of two peptide-PNA conjugates could trigger the formation of a new peptide with proapoptotic properties. The method draws upon a nucleic acid-templated reaction, in which two short PNA oligomers bind adjacently on a complementary DNA template enabling the transfer of an amino acyl group. In the presented study one oligomer carried an alanine residue that was C-terminally attached to the PNA sequence via a thioester linkage. The second PNA oligomer conferred a peptide with an N-terminal cysteine residue and served as acceptor. In a cysteine mediated transfer reaction an amino acyl moiety was transferred to the acceptor conjugate yielding a free PNA oligomer and a new peptide. The generated peptide-PNA conjugates were designed to bind BIR3 protein and therefore interrupt its interaction with caspase-9 a key enzyme of apoptosis. In a cell free functional assay, which included recombinant BIR3 protein and HEK293 cell lysate, the peptide-PNA conjugates formed upon the DNA-triggered peptide synthesis acted as BIR3 antagonists and allowed reactivation of inhibited initiator caspase-9 as well as of the executioner caspase-3. Preliminary studies for future intracellular applications of this method included the investigation of the stability of the peptide-PNA conjugates in cell lysate and the development of a synthetic strategy for the PEGylation of the conjugates. With the DNA-triggered peptide synthesis via aminoacyl transfer we introduced a method, which allows for the translation of nucleic acid information into the output of molecules that interfere with disease-related protein-protein interactions. The synthesis of the active peptide drug proceeds sequence specifically and shows turnover in template even in a complex biomolecular environment such as cell lysate.