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2012-10-04Dissertation DOI: 10.18452/16595
Ein 3D-Modell des Ribosomen-gebundenen OST-Sec61-Translokons
dc.contributor.authorFalke, Kristian
dc.date.accessioned2017-06-18T11:46:10Z
dc.date.available2017-06-18T11:46:10Z
dc.date.created2012-10-15
dc.date.issued2012-10-04
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/17247
dc.description.abstractGleich einem Etikett dient die N-Glykokosylierung vom Ribosom neu synthetisierter Proteine durch die Oligosaccharyltransferase (OST) bei der kotranslationalen Translokation in das Endoplasmatische Retikulum (ER) als Startpunkt vielschichtiger Prozessierungen. Bisher fehlte der strukturelle Nachweis, dass die OST als mit dem Ribosom assoziierten Membranprotein (RAMP) Bestandteil des auf dem proteinleitenden Kanal, dem Sec61-Komplex, basierenden Translokons ist. In dieser Arbeit berichten wir von der kryoelektronenmikroskopischen 3D-Struktur eines definierten OST-Sec61-Ribosom-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae bei 15,4 Å Auflösung. Dazu wurden die Komponenten (OST, Sec61 und Ribosomen mit naszierender Proteinkette) affinitätschromatographisch gereinigt und das Bindungsverhalten mit 80S-Ribosomen in vitro untersucht. Die OST band mit einer KD von 12,8 nM hochaffin und spezifisch an den bekannten Sec61-Ribosomen-Komplex. Dieser in vitro rekonstituierte trimere Komplex zeigte eine neuartige eng an das Ribosom anschließende Translokonstruktur mit zwei bisher unbekannten ribosomalen Verbindungen, einer einzigen dezentralen porenförmigen Vertiefung und zusätzlichen luminalen Bereichen. Durch das Docken eines Sec61-Homologs in einer alternativen Bindeposition sowie das Docken eines Stt3p-Homologs (der katalytischen Untereinheit der OST) und mit Hilfe der mittels (Kryo-)Negativkontrastierung gewonnenen 3D-Struktur der OST konnten Hybridmodelle erstellt werden. Daraus wurde unter Einbeziehung von bekannten molekularbiologisch gewonnenen Interaktionsdaten das 3D-Modell eines aktiven Ribosomen-gebundenen OST-Sec61-Translokons entwickelt.ger
dc.description.abstractLike a label, N-glycosylation by the oligosaccharyltransferase (OST) of newly synthesized proteins emerging from the ribosome while being cotranslationally translocated into the endoplasmic reticulum (ER) provides a starting point for a multitude of processes. Hitherto no structural proof has been presented, that the OST as a ribosome associated membrane protein (RAMP) is a constituent of the translocon, based at its core on the protein conducting channel (Sec61-complex). In this work we report on the 3D-structure of a defined OST-Sec61-ribosome complex from Saccharomyces cerevisiae by cryo-electron microscopy at 15.4 Å resolution. Thereto, the components (OST, Sec61, ribosome nascent chain complexes) have been purified by affinity chromatography and the binding of 80S-ribosomes has been checked in vitro. The OST bound with high affinity by a KD of 12.8 nM specifically to the established Sec61-ribosome complex. This trimeric complex reconstituted in vitro exhibits a new kind of tightly bound ribosomal translocon showing two hitherto unknown connections to the ribosome, a single off-center pore-like indentation and an additional luminal domain. By docking of a Sec61 homologue at an alternative binding position plus the docking of a Stt3p homologue (the catalytic subunit of the OST) and by means of the 3D-structure of the OST using the (cryo-)negative staining technique, hybrid models could be created. Consequently, integrating known interaction data from molecular biology experiments has been used to develop a 3D-model of an active ribosome-bound OST-Sec61-translocon.eng
dc.language.isoger
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
dc.rightsNamensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Weitergabe unter gleichen Bedingungen
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/de/
dc.subject3Dger
dc.subjectKryoelektronenmikroskopieger
dc.subjectHybrid-Modellger
dc.subjectRibosomen-assoziierte Membranproteine (RAMPs)ger
dc.subjectTranslokonger
dc.subjectkotranslationalger
dc.subjectSec61-Komplexger
dc.subjectOligosaccharyltransferase (OST)ger
dc.subjectcryo-electron microscopyeng
dc.subject3Deng
dc.subjecthybrid modeleng
dc.subjectribosome associated membrane proteins (RAMPs)eng
dc.subjecttransloconeng
dc.subjectcotranslationallyeng
dc.subjectSec61-complexeng
dc.subjectoligosaccharyltransferase (OST)eng
dc.subject.ddc570 Biowissenschaften, Biologie
dc.titleEin 3D-Modell des Ribosomen-gebundenen OST-Sec61-Translokons
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-100204806
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/16595
dc.identifier.alephidBV040462053
dc.date.accepted2012-09-28
dc.contributor.refereeSpahn, Christian
dc.contributor.refereeBeckmann, Roland
dc.contributor.refereeDobbek, Holger
dc.subject.dnb32 Biologie
dc.subject.rvkWE 3300
local.edoc.pages118
local.edoc.type-nameDissertation
local.edoc.institutionMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I

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