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2012-10-26Dissertation DOI: 10.18452/16603
Beyond the limit
dc.contributor.authorMainz, Andi
dc.date.accessioned2017-06-18T11:47:59Z
dc.date.available2017-06-18T11:47:59Z
dc.date.created2012-10-31
dc.date.issued2012-10-26
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/17255
dc.description.abstractStrukturelle Untersuchungen mittels Lösungs-NMR Spektroskopie sind für supramolekulare Maschinen mit Molekulargewichten von mehr als 150 kDa nur beschränkt möglich. Die Festkörper-NMR mit Probenrotation im sogenannten magischen Winkel (MAS) stellt dagegen eine molekulargewichtsunabhängige Methode dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue Methode entwickelt, die die MAS NMR Spektroskopie an supramolekularen Komplexen in Lösung erlaubt. Proteinlösungen bilden demnach durch MAS und dessen Ultrazentrifugationseffekt homogene Proteinsedimente aus, in denen die rotatorische Diffusion großer Proteinkomplexe überwiegend aufgehoben ist. Auf diese Weise können klassische Festkörper-NMR Methoden angewandt werden, ohne dass Präzipitations- oder Kristallisationsverfahren erforderlich sind. In Kombination mit Proteindeuterierung, Protonendetektion sowie paramagnetischer Relaxationsverstärkung ermöglichte diese neuartige Methode die Zuordnung von Rückgrat-Amidresonanzen des 20S Proteasoms mit einem Molekulargewicht von 1,1 MDa. Weiterhin wurde diese Methode zur Untersuchung des kleinen Hitzeschockproteins alpha-B-Crystallin und dessen Cu(II)-Bindungseigenschaften genutzt. Das Chaperon (600 kDa) spielt eine wesentliche Rolle in der zellulären Proteinhomeostase. Verschiedenste NMR Techniken und andere biophysikalische Methoden zeigen, dass die konservierte alpha-Crystallin-Domäne ein Cu(II)-Ion nahe der Monomer-Monomer Interaktionsfläche mit pikomolarer Affinität bindet. Die Cu(II)-induzierte Freilegung von Substrat-Interaktionsflächen und Veränderungen in der dynamischen Quartärstruktur modulieren so die oligomere Architektur und die Chaperonaktivität von alpha-B-Crystallin. Die hier erstmals beschriebene MAS NMR Spektroskopie von sedimentierten Biomolekülen legt einen wichtigen Grundstein für zukünftige Struktur- und Dynamikuntersuchungen an großen molekularen Maschinen.ger
dc.description.abstractStructural investigations of large biomolecules by solution-state NMR are challenging in case the molecular weight of the complex exceeds 150 kDa. Magic-angle-spinning (MAS) solid-state NMR is a powerful tool for the characterization of biomolecular systems irrespective of their molecular weight. In this work, an approach was developed, which enables the investigation of supramolecular modules by MAS NMR. Protein solutions can yield fairly homogeneous sediments due to the ultracentrifugal forces during MAS. Since rotational diffusion is impaired, typical solid-state NMR techniques can thus be applied without the need of precipitation or crystallization. This new approach in combination with protein deuteration, proton-detection and paramagnetic relaxation enhancement enabled the observation and the assignment of backbone amide resonances of a 20S proteasome assembly with a molecular weight of 1.1 MDa. Similarly, the approach was used to characterize the small heat-shock protein alpha-B-crystallin with respect to its Cu(II)-dependent chaperone activity. The chaperone (600 kDa) plays an essential role in cellular protein homeostasis. We show that the conserved alpha-crystallin core domain is the elementary Cu(II)-binding unit specifically coordinating one Cu(II) ion near to the dimer interface with picomolar binding affinity. We suggest that Cu(II)-binding unblocks potential client binding sites and alters quaternary dynamics of both the dimeric building block as well as the higher-order assemblies of alpha-B-crystallin. In summary, MAS NMR employed to biomolecules in solution is a very promising tool to explore structural and dynamic properties of large biological machines with no upper size limit.eng
dc.language.isoeng
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
dc.rightsNamensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/
dc.subjectMagic-angle-spinning NMRger
dc.subjectProteinkomplexeger
dc.subjectalpha-B-Crystallinger
dc.subjectChaperoneger
dc.subjectKleine Hitzeschockproteineger
dc.subjectKupferbindungger
dc.subjectAlzheimer Krankheitger
dc.subjectBeta-Amyloidger
dc.subjectmagic-angle-spinning NMReng
dc.subjectprotein complexeseng
dc.subjectalpha-B-crystallineng
dc.subjectchaperoneseng
dc.subjectsmall heat-shock proteinseng
dc.subjectcopper bindingeng
dc.subjectalzheimers diseaseeng
dc.subjectbeta amyloideng
dc.subject.ddc570 Biologie
dc.titleBeyond the limit
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-100205415
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/16603
dc.identifier.alephidBV040514180
dc.date.accepted2012-08-27
dc.contributor.refereeReif, Bernd
dc.contributor.refereeOschkinat, Harmut
dc.contributor.refereeDobbek, Holger
dc.subject.dnb32 Biologie
dc.subject.rvkVG 9500
local.edoc.pages194
local.edoc.type-nameDissertation
dc.title.subtitlenuclear magnetic resonance investigations of supramolecular assemblies
bua.departmentMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I

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