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2013-05-03Dissertation DOI: 10.18452/16748
Synthese und Screening von Inhibitoren der mikroRNA-Reifung
dc.contributor.authorDojahn, Claudine
dc.date.accessioned2017-06-18T12:21:53Z
dc.date.available2017-06-18T12:21:53Z
dc.date.created2013-06-05
dc.date.issued2013-05-03
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/17400
dc.description.abstractDas Ziel dieser Arbeit war die Synthese niedermolekularer Verbindungen, die an die prä-miRNA binden und dadurch die Reifung zur miRNA inhibieren. Daher sollten die RNA-Binder 2-Desoxystreptamin sowie Neamin mit Alkinen funktionalisiert und durch Kupfer-katalysierte Azid-Alkin 1,3-dipolare Cycloaddition (CuAAC) mit verschiedenen bivalenten Aziden verknüpft werden. Im Rahmen dieses Projekts wurde der synthetische Zugang zu den benötigten Alkin- sowie Azid-funktionalisierten Grundbausteinen optimiert. Ferner wurde ein effektives und zuverlässiges Protokoll für die CuAAC erarbeitet, welches es ermöglichte, 88 Testsubstanzen in guter Ausbeute und hoher Reinheit zu isolieren. Anschließend wurde die Substanzbibliothek in einem BRCA-Reifungsassay unter kompetitiven Bedingungen auf die Inhibition der miRNA-Reifung getestet. Dabei wurden mehrere potente Inhibitoren der miRNA-Reifung mit IC50-Werten von bis zu 0.5 µM identifiziert. Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Etablierung einer chemo-enzymatische RNA-Funktionalisierungsstrategie um prä-miRNA-Sonden herzustellen: In-vitro-Transkriptionen mit der T7-RNA-Polymerase sowie Ligationen mit der T4 RNA Ligase 1 waren das Fundament der enzymatischen RNA-Synthese, während die Funktionalisierung der RNA durch CuAAC erzielt wurde. Dafür wurden die neuen Verbindungen O-(5‘-Guanosin)-O-propargylmonophosphat sowie 3‘,5‘-O,O-Bisphosphat-5-ethinyluridin synthetisiert, durch in-vitro-Tran¬skription an das 5‘-Ende von prä-miRNAs eingeführt und anschließend durch CuAAC mit einem Fluoreszenzlöscher modifiziert. Das Uridinbisphosphat wurde durch CuAAC mit einem Fluorophor markiert und anschließend effizient mit der T4 RNA Ligase 1 an das 3‘-Ende verschiedener prä-miRNAs ligiert. Darüber hinaus war es auch möglich, das Alkin-modifizierte Uridinbisphosphat an das 3‘-Ende von prä-miRNAs zu ligieren, dieses durch eine zweite Ligation an eine definierte interne Position zu verschieben und abschließend durch CuAAC zu funktionalisieren.ger
dc.description.abstractThe objective of this work was the synthesis of small molecules, which bind to pre-miRNAs to prevent their maturation to fully active miRNAs. To create a substance library of bivalent inhibitors, the RNA binding motifs 2-deoxystreptamine as well as neamine were alkyne modified and linked with several bisazides via a copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC). Hence, optimized syntheses of the basic building blocks along with an effective and reliable CuAAC-protocol were established. 88 test substances were isolated in good yield and high purity. Finally they were analyzed with regard to their potential to selectively inhibit the miRNA maturation. For this purpose, the assay was performed under competitive conditions with a set of two pre-miRNA-pairs. The initial screening revealed several inhibitors with IC50-values in the lower µM range. The second focus of this work was on the development of a synthetic access to alkyne modified ribonucleotides to establish a chemo-enzymatic functionalization strategy for RNAs using in-vitro-transcription, ligation and CuAAC. In this context, the syntheses of 3‘,5‘-O,O-bisphosphate-5-ethinyl uridine and O-(5‘-guanosine)-O-propargyl monophos-phate are described for the first time. The guanosine monophosphate was used as transcription starter to address the 5’-end of RNA and was consecutively labeled with an azido-tagged quencher. The uridine bisphosphate was conjugated with a fluorophor and introduced to the 3’-end of RNAs by T4 RNA ligase 1. Moreover, the uridine bisphosphate can be ligated to the 3’-end without a fluorophor attached, to serve as a connecting point for a further ligation with an oligonucleotide of any length. Thereby, the former terminal alkynylated uridine was shifted to a defined internal position by successive enzymatic reactions and was successfully derivatized with a fluorophor by CuAAC.eng
dc.language.isoger
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
dc.rightsNamensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/
dc.subjectInhibitionger
dc.subjectprä-miRNAger
dc.subjectRNA-Erkennungger
dc.subjectCuAACger
dc.subject2-Desoxystreptaminger
dc.subjectNeaminger
dc.subjectTranskriptionsstarterger
dc.subjectFunktionalisierung von RNAger
dc.subjectinhibitioneng
dc.subjectpre-miRNAeng
dc.subjectRNA recognitioneng
dc.subjectaminoglycosideseng
dc.subject2-deoxystreptamineeng
dc.subjectneamineeng
dc.subjectCuAACeng
dc.subjectRNA functionalizationeng
dc.subject.ddc540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.titleSynthese und Screening von Inhibitoren der mikroRNA-Reifung
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-100210336
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/16748
dc.identifier.alephidBV041066957
dc.date.accepted2013-03-04
dc.contributor.refereeArenz, Christoph
dc.contributor.refereeSeitz, Oliver
dc.subject.dnb30 Chemie
local.edoc.pages206
local.edoc.type-nameDissertation
bua.departmentMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I

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