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2014-05-26Dissertation DOI: 10.18452/16962
Kombination chemischer, gentechnischer und enzymatischer Methoden zur Darstellung schwer synthetisierbarer Proteine
dc.contributor.authorAbel, Sabine
dc.date.accessioned2017-06-18T13:06:39Z
dc.date.available2017-06-18T13:06:39Z
dc.date.created2014-05-28
dc.date.issued2014-05-26
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/17614
dc.description.abstractDas fibrillen-bildende beta2-Mikroglobulin (b2M) und das CRF1-Mimetikum mit verzweigter Rückgratstruktur können als „schwierige“ Proteine betrachtet werden, deren Darstellung sich eignet, gegenwärtige Möglichkeiten und Grenzen der Proteinsynthese zu ermitteln. Die Proteine sollen zu spektroskopischen Untersuchungen von Proteinfaltung bzw. Ligand-Rezeptor- Wechselwirkungen eingesetzt werden. Versuche zur Chemosynthese von b2M über drei Segmente führten per NCL zwar zu linearen Produkten mit korrekter Primärstruktur, aber wiederholt wurden zwei, mittels HPLC trennbare Proteine erhalten, deren enzymatische Spaltung zu identischen Fragmenten führte. Eine Isomerisierung (wie z.B. Epimerisierung) als Ursache für die Bildung der zwei Produkte konnte ausgeschlossen werden. Mittels CD- und FTIR-Spektroskopie wurden für beide Produkte beta- Faltblatt-Strukturen ermittelt, die sich sowohl untereinander als auch vom rekombinanten Protein unterschieden. Die „fehlgefalteten“ Syntheseprodukte konnten nicht entfaltet und anschließend in die „korrekte“ Struktur des rekombinanten b2M überführt werden. Es ist denkbar, dass die beobachtete „Fehlfaltung“, deren Ursache nicht geklärt werden konnte, für vom b2M ausgelöste Amyloidosen verantwortlich ist. Das CRF1-Modell, das aus drei zyklischen Peptiden und einem Protein mit Disulfidbrücken besteht, welche auf einem linearen Peptid-Templat verankert sind, wurde durch ein zyklisches Templat zur strukturellen Einschränkung modifiziert. Durch das zyklische Templat ergaben sich keine Syntheseprobleme, aber interessanterweise führte die Zyklisierung des Templats zu einer signifikant höheren Affinität für den Agonisten Urocortin-I im funktionellen Assay. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ein zyklisches Rezeptor-Loop-Peptid mittels EPL im mg-Maßstab erhalten werden kann, was künftig die Synthese isotopenmarkierter Analoga für Struktur-Untersuchungen ermöglicht.ger
dc.description.abstractThe fibril forming beta2-microglobulin (b2m) and the CRF1 mimic with branched peptide backbone could be considered as “difficult” proteins, whose synthesis is suited for determining present possibilities and limits of protein synthesis. The proteins shall be used for spectroscopic analysis of protein misfolding or ligand-receptor-interaction, respectively. Efforts of the chemosynthesis of b2m over three segments may lead via NCL to linear products with correct primary structure, but two, via HPLC isolatable proteins were repetitively susbstained, whose enzymatic digest lead to identical fragments. An isomerization (such as e. g. epimerization) as reason for the formation of the two products could be excluded. By means of CD and FTIR spectroscopy for both products beta-sheet structure were determined, which differ among themselves as well as from the recombinant protein. The “misfolded” synthetic product could not be unfolded und subsequently converted into the “correct” structure of the recombinant b2m. It is possible that the observed “misfolding”, whose cause could not be clarified, is reasonable for the amyloidosis induced by b2m. The CRF1 model that consists of three cyclic peptides and one protein with disulfid bridges coupled to a linear peptide template, was modified for structural constraints by a cyclic template. In consequence of the cyclic template no synthetic problems aroused, although the cyclisation of the template leads interestingly to a significant higher affinity for the antagonist urocortin-I in the functional assay. Furthermore, it was shown that a cyclic receptor loop peptide could be received via EPL in mg scale, what in future enables the synthesis of isotopically labeled analogs for structure investigations.eng
dc.language.isoger
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
dc.rightsNamensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/
dc.subjectProteinsyntheseger
dc.subjectbeta2-Mikroglobulinger
dc.subjectnative chemische Ligationger
dc.subjectRezeptorkonstrukteger
dc.subjectG-Protein gekoppelte Rezeptorenger
dc.subjectexpressed Protein Ligationger
dc.subjectnative chemical ligationeng
dc.subjectprotein synthesiseng
dc.subjectbeta2-microglobulineng
dc.subjectreceptor mimicseng
dc.subjectG-protein coupled receptorseng
dc.subjectexpressed protein ligationeng
dc.subject.ddc540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.titleKombination chemischer, gentechnischer und enzymatischer Methoden zur Darstellung schwer synthetisierbarer Proteine
dc.typedoctoralThesis
dc.subtitleMöglichkeiten und Grenzen
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-100217577
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/16962
dc.identifier.alephidBV041883528
dc.date.accepted2014-04-22
dc.contributor.refereeSeitz, Oliver
dc.contributor.refereeHackenberger, Christian P. R.
dc.subject.dnb30 Chemie
dc.subject.rvkVK 8567
local.edoc.pages141
local.edoc.type-nameDissertation
local.edoc.institutionMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I

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