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2014-05-30Dissertation DOI: 10.18452/16969
Die Analyse der Sauerstofftoleranz und biotechnologische Anwendung der NAD+-reduzierenden Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16
dc.contributor.authorLauterbach, Lars
dc.date.accessioned2017-06-18T13:08:03Z
dc.date.available2017-06-18T13:08:03Z
dc.date.created2014-06-03
dc.date.issued2014-05-30
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/17621
dc.description.abstractDie NAD+-reduzierende Hydrogenase aus Ralstonia eutropha (SH) katalysiert die reversible H2-Oxidation in Verbindung mit der Reduktion von NAD+ in Gegenwart von Sauerstoff. Die bemerkenswerte O2-Toleranz des Enzyms wurde zuvor auf eine für [NiFe]-Hydrogenasen ungewöhnliche Struktur des Wasserstoff-spaltenden Zentrums zurückgeführt. Diese Hypothese wurde in dieser Arbeit mittels in situ-Spektroskopie an SH-haltigen Zellen widerlegt. Um die folgende Untersuchung der aus sechs Untereinheiten und mindestens acht Kofaktoren bestehenden SH zu erleichtern, wurde das Enzym mittels genetischer Methoden in seine beiden Module aufgeteilt. Das die H2-Oxidation katalysierende Hydrogenase-Modul beinhaltete ein FMN-Molekül, welches für die reduktive Reaktivierung des oxidativ modifizierten Zentrums benötigt wird. Das Diaphorase-Modul besaß ebenfalls ein FMN, und die Reduktion von NAD+ wurde von der Anwesenheit von O2 nicht beeinträchtigt. Neben Wasserstoff reagierte das [NiFe]-Zentrum der SH auch mit Sauerstoff. Dabei wurde sowohl Wasserstoffperoxid- als auch Wasser im Hydrogenase-Modul freigesetzt. Die Sauerstofftoleranz der SH basiert auf einer kontinuierlichen Reaktivierung des durch Sauerstoff oxidierten [NiFe]-Zentrums. Aufgrund der außergewöhnlichen Sauerstofftoleranz stellt die SH ein vielversprechendes System für die wasserstoffgetriebene Regeneration von NADH in gekoppelten enzymatischen Reaktionen dar. In dieser Arbeit wurde ein SH-Derivat durch rationale Mutagenese konstruiert, das in der Lage war, ebenso den Kofaktor NADP+ wasserstoffabhängig zu reduzieren. Durch Ganzzellansätze kann die zeitaufwändige und kostenintensive Proteinreinigung vermieden werden. Um die wasserstoffabhängige in-vivo-Kofaktorregeneration zu ermöglichen, wurde die SH in Pseudomonas putida heterolog produziert. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse sind sowohl für das molekulare Verständnis der H2-abhängigen Katalyse als auch für die biotechnologische Anwendung der O2-toleranten SH relevant.ger
dc.description.abstractThe NAD+ reducing hydrogenase from Ralstonia eutropha (SH) catalyzes the reversible oxidation of hydrogen in connection with the reduction of NAD+ in the presence of oxygen. The remarkable oxygen tolerance was previously related to an unusual [NiFe] active site with four instead of two cyanide ligands. This hypothesis was rejected in this study by using in situ spectroscopy on SH containing cells. To simplify the investigation of the six-subunit and at least eight cofactors containing SH, the enzyme was separated into its two modules by genetic methods. The hydrogen oxidizing hydrogenase module contained one FMN molecule, which was required for the reductive reactivation of the oxidatively modified active site. The diaphorase module carried a second FMN. The reduction of NAD+ was not affected by the presence of oxygen. In addition to hydrogen, the [NiFe] center of the SH reacted with oxygen. Both hydrogen peroxide and water were released by the hydrogenase module. The oxygen tolerance of the SH is based on a continuous reactivation of the oxidized [NiFe] center. Due to the oxygen tolerance, the SH is a promising system for hydrogen based NADH regeneration in coupled enzymatic reactions. In this study a SH derivative was constructed by means of rational mutagenesis. The SH derivative was able to reduce the cofactor NADP+ by hydrogen oxidation. The time consuming and costly protein purification can be avoided by using whole cell approaches. In order to allow the hydrogen dependent in vivo cofactor regeneration, SH was heterologously produced in Pseudomonas putida. The results obtained in this study are relevant for the molecular understanding of hydrogen dependent catalysis and for the biotechnological application of the oxygen tolerant SH.eng
dc.language.isoger
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
dc.rightsNamensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/
dc.subjectElektrochemieger
dc.subjectWasserger
dc.subjectHydrogenaseger
dc.subjectEisen-Schwefel-Clusterger
dc.subjectRalstonia eutrophager
dc.subjectSauerstofftoleranzger
dc.subjectAktives Zentrumger
dc.subjectNADH-Regenerationger
dc.subjectDiaphoraseger
dc.subjectFTIRger
dc.subjectKomplex Iger
dc.subjectFMNger
dc.subjectFlavinmononukleotidger
dc.subjectWasserstoffperoxidger
dc.subjectFTIReng
dc.subjectelectrochemistryeng
dc.subjectwatereng
dc.subjectoxygen toleranceeng
dc.subjectRalstonia eutrophaeng
dc.subjectactive siteeng
dc.subjecthydrogenaseeng
dc.subjectNADH regenerationeng
dc.subjectdiaphoraseeng
dc.subjectComplex Ieng
dc.subjectFe-S Clustereng
dc.subjectFMNeng
dc.subjectflavin mononucleotideeng
dc.subjecthydrogen peroxideeng
dc.subject.ddc570 Biologie
dc.titleDie Analyse der Sauerstofftoleranz und biotechnologische Anwendung der NAD+-reduzierenden Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-100217694
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/16969
dc.identifier.alephidBV041888685
dc.date.accepted2013-12-13
dc.contributor.refereeFriedrich, B.
dc.contributor.refereeHildebrandt, P.
dc.contributor.refereeDobbek, H.
dc.subject.dnb32 Biologie
dc.subject.rvkWD 5050
local.edoc.pages179
local.edoc.type-nameDissertation
local.edoc.institutionMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I

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