Chemische Synthese & funktionelle Analyse von immobilisierten Protein-Domänen

Abstract

Protein-Arrays sind das Mittel der Wahl, um eine Vielzahl von Proteinen parallel zu untersuchen. Ziele dieser Untersuchungen sind meistens Proteininteraktionsnetzwerke zu entdecken oder besser verstehen zu können. Bisher wurden die benötigten Proteine fast ausschließlich mit biologischen Methoden gewonnen. Diese bieten allerdings keinen generellen Zugang zu posttranslational-modi-fizierten (PTM)-Proteinen. Somit war es bisher nicht möglich den Einfluss von PTMs auf Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) im Arrayformat zu untersuchen. Die chemische Synthese kann dagegen Proteine mit ortsspezifischen PTMs liefern. Daher ist es verwunderlich, dass bislang noch keine Berichte über chemisch hergestellte PTM-Protein-Arrays existieren, besonders da PTMs meist entscheidend für proteomische Interaktionsnetzwerke sind. In der vorliegenden Arbeit wird eine Methodik beschrieben, die es ermöglicht PTM-modifizierte Protein-Domänen-Arrays auf der Oberfläche zu synthetisieren und zu analysieren. Mit der Methodik wurden 20 SH3-Domänen synthetisiert und 64 PPIs gemessen. Neben vier Hefe-SH3-Domänen wurden je acht humane (Phospho)SH3-Domänen der Abl- und Arg(Abl2)-Tyrosinkinase synthetisiert und funktionell untersucht. Es wurde gefunden, dass die Ligandenspezifität von Abl-SH3-Domänen durch Phosphorylierung feinreguliert wird. Je nach Phosphorylierungsmustern wurde die Affinität für spezifische Liganden erhöht oder erniedrigt. Der Ursprung dieser Phosphoregulierung wurde für die Abl-SH3-Domäne mit Hilfe der NMR-Spektroskopie und durch Zellexperimente versucht zu entschlüsseln und weiter validiert.

Protein-arrays are the method of choice to investigate a variety of proteins in a parallel fashion. Objectives of these studies are mostly to discover or to investigate protein interaction networks. So far, the necessary proteins were almost exclusively gained by biological methods. Unfortunately, generic access to proteins bearing post-translational modifications (PTM) is not provided by these techniques. Therefore, it was not possible to investigate the impact of PTMs on protein-protein-interactions (PPIs) on arrays so far. Chemical synthesis in contrast offers proteins with site-specific PTM incorporation. In this context, it is surprising, that chemical methods of PTM-protein array synthesis remained virtually unexplored, especially since these modifications are usually crucial for proteomic interaction networks. In this thesis, a methodology is described, that allows to synthesize and functional analyse post-translationally modified protein domain arrays on the surface. By using this methodology, 20 SH3 domains were synthesized and 64 protein-pep-tide interactions were measured. In addition to 4 yeast SH3 domains, 8 human (phospho) SH3 domains of the Abl and Arg(Abl2) tyrosine kinase were synthesized and functionally investigated. The experiments revealed that phosphorylation might serve as a means to fine tune the ligand recognition. Depending on the phosphorylation pattern the affinity to specific interaction partners were enhanced or reduced. The origin of this phosphoregulation was further investigated for the Abl SH3 domain by means of NMR spectroscopy and cellular experiments.