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2018-09-06Dissertation DOI: 10.18452/19397
Spektroskopische Charakterisierung der grün-absorbierenden Kanalrhodopsin-Chimäre ReaChR
dc.contributor.authorKrause, Benjamin Sören
dc.date.accessioned2018-09-06T12:33:16Z
dc.date.available2018-09-06T12:33:16Z
dc.date.issued2018-09-06
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/20161
dc.description.abstractKanalrhodopsine (ChRs) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle, welche nach Absorption eines Photons durch den Retinal-Cofaktor einen passiven Ionentransport über die Zellmembran katalysieren. Im Zuge von optogenetischen Anwendungen wird diese Reaktion für die Beeinflussung der Ionenhomöostase von verschiedenen Zelltypen und Geweben ausgenutzt. Zu Beginn dieser Arbeit wurden lichtinduzierte Strukturänderungen und Protontransferschritte in einem breiten Zeitbereich (Nanosekunden bis Minuten) in dem grün-absorbierenden ChR ReaChR mithilfe von stationärer und transienter UV-vis- und Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FTIR) untersucht. Auf Basis der experimentellen Daten wurde ein komplexes Photozyklus-Modell konzipiert. Anschließend wurde die IR-aktive, nichtkanonische Aminosäure p-Azido-L-phenylalanin (azF) mittels Stopp-Codon-Suppression ortsspezifisch an mehreren Positionen innerhalb der vermuteten ionenleitenden Kanalpore in ReaChR inkorporiert und mit FTIR untersucht. azF ist sensitiv gegenüber Polaritätsänderungen und absorbiert in einem hochfrequenten Bereich (~2100 cm-1). Aufgrund der großen spektralen Separation zu endogenen Proteinschwingungen (< 1800 cm-1) können globale Konformations- und lokale Hydratisierungsänderungen simultan detektiert werden. Die erhobenen Daten leisten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Bildung einer temporären Wasserpore in ChRs und demonstrieren zum ersten Mal den erfolgreichen in-vivo-Einbau einer artifiziellen Aminosäure in mikrobielle Rhodopsine und dessen schwingungsspektroskopische Analyse. Die Methode bietet aufgrund ihrer hohen Ortsauflösung ein großes Potential für die Studie von Mikroumgebungen innerhalb komplexer Proteinensemble.ger
dc.description.abstractChannelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels. Upon absorption of a photon, the retinal chromophore isomerizes and drives conformational changes within the protein, which lead to a passive ion transport across the cell membrane. This capability is used for optogenetic applications to manipulate ionic homeostasis of different cell types and entire organisms. Within the work, light-induced structural changes and proton transfer steps were studied in the green-absorbing ChR ReaChR in great detail by steady-state and transient UV-vis and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The data were merged into a complex photocycle model. Next, the IR-active, unnatural amino acid p-azido-L-phenylalanine (azF) was site-specifically introduced at several sites of the putative ion pore of ReaChR by stop codon suppression. azF is sensitive to polarity changes and absorbs in a clear spectral window lacking endogenous protein vibrations. Thus, FTIR measurements of labeled mutants report for global conformational changes (< 1800 cm-1) and local hydration changes (~2100 cm-1) simultaneously. The presented findings reveal crucial insights regarding formation of a transient water pore in ChRs and demonstrate the first report of the successful in-vivo incorporation of an artificial amino acid into a microbial rhodopsin and its subsequent spectroscopic investigation. Additionally, the so far unprecedented spatial resolution renders this methodology superior over conventional FTIR methods to study microenvironments within complex protein ensembles.eng
dc.language.isoger
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin
dc.rights(CC BY-NC-ND 3.0 DE) Namensnennung - Nicht-kommerziell - Keine Bearbeitung 3.0 Deutschlandger
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/
dc.subjectKanalrhodopsinger
dc.subjectPhotozyklusger
dc.subjectProtontransferreaktionenger
dc.subjectUV-vis-Spektroskopieger
dc.subjectFTIRger
dc.subjectUnnatürliche Aminosäurenger
dc.subjectStopp-Codon-Suppressionger
dc.subjectchannelrhodopsineng
dc.subjectphotocycleeng
dc.subjectproton transfer reactionseng
dc.subjectUV-vis spectroscopyeng
dc.subjectFTIReng
dc.subjectunnatural amino acidseng
dc.subjectstop codon suppressioneng
dc.subject.ddc570 Biowissenschaften; Biologie
dc.titleSpektroskopische Charakterisierung der grün-absorbierenden Kanalrhodopsin-Chimäre ReaChR
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-110-18452/20161-6
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/19397
dc.date.accepted2018-02-02
dc.contributor.refereeHegemann, Peter
dc.contributor.refereeBartl, Franz Josef
dc.contributor.refereeHildebrandt, Peter
dc.subject.rvkWD 2800
dc.subject.rvkWD 2200
dc.subject.rvkWE 5460
dc.subject.rvkWF 9746
local.edoc.pages302
local.edoc.type-nameDissertation
local.edoc.institutionLebenswissenschaftliche Fakultät

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