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2019-05-16Dissertation DOI: 10.18452/19973
Dissecting the protein interaction pattern of Influenza A virus nuclear export complex - A fluorescence fluctuation spectroscopy approach
dc.contributor.authorLuckner, Madlen
dc.date.accessioned2019-05-16T08:01:01Z
dc.date.available2019-05-16T08:01:01Z
dc.date.issued2019-05-16none
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/20750
dc.description.abstractIm Unterschied zu anderen RNA Viren vervielfältigen Influenzaviren ihr Genom im Zellkern infizierter Zellen. Für die erfolgreiche Vermehrung müssen neu gebildete Genomsegmente (virale Ribonukleoproteine, vRNPs) wieder aus dem Zellkern exportiert werden. Dafür nutzt Influenza einen Exportkomplex, der sich aus dem viralen Matrixprotein 1 (M1) und Nukleusexportprotein (NEP) zusammensetzt und vRNPs unter Verwendung des zellulären Exportproteins CRM1 aus dem Zellkern transportiert. Zahlreiche Fragen im Zusammenhang mit dem Exportkomplex sind noch unbeantwortet: Wie viele Exportkomplexe werden pro vRNP gebunden? Wie interagieren die Proteine innerhalb des Komplexes mit vRNPs? Wie wird die zeitliche und räumliche Präsenz der beteiligten Proteine im Verlauf der Infektion reguliert? Um zu einem besseren Verständnis beizutragen, wurden in der vorliegenden Arbeit Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie und molecular brightness-Analysen genutzt, um die Oligomerisierung der beteiligten Exportkomplexproteine zu quantifizieren. Werden Fluoreszenzproteine für solche Untersuchungen verwendet, treten häufig nicht-fluoreszente Zustände auf, die die Bestimmung des Oligomerzustandes beeinflussen. Daher wurde in dieser Arbeit ein einfaches Korrekturmodel vorgestellt, das die Population an nicht-fluoreszenten Zuständen berücksichtigt, und somit die genaue Bestimmung des Oligomerzustandes erlaubt. Dadurch konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass NEP Homodimere im Zytoplasma ausbildet, wohingegen eine um das 2,5-fach geringere Homodimerpopulation im Zellkern vorhanden war. Durch die Integration von Informationen über den Lokalisationsphänotyp und den Oligomerzustand von NEP sowie mehrerer Mutanten, konnte ein Modell abgeleitet werden, dass den Regulationsmechanismus beschreibt: Durch vorrübergehendes Maskieren und Demaskieren der beiden Nukleusexportsignale wird der Transport von NEP reguliert. Die Dimerisierung im Zytoplasma und Monomerisierung im Zellkern unterstützen diesen Mechanismus.ger
dc.description.abstractInfluenza viruses are the causative agent of severe epidemics and pandemics, causing up to 650,000 deaths annually. Unlike other RNA viruses, Influenza viruses replicate their genome within the nucleus of cells. Hence, progeny genome segments - viral ribonucleoproteins (vRNPs) - need to be exported from the nucleus to complete the replication cycle. To fulfil this task, Influenza relies on a viral nuclear export complex built from M1 and NEP, that mediates export by hijacking the cellular CRM1-dependent export machinery. In this context a number of questions remain unanswered, such as how many export complexes bind to a single vRNP, what is the exact interaction pattern of vRNPs with export complex proteins, and how translocation of nuclear export relevant proteins such as NEP are regulated and optimally timed during the course of infection? In the present study, the potential of NEP to form homo-dimers in situ was shown for the first time by applying fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) and molecular brightness analysis, that allows determination of protein oligomerization in living cells. However, when using fluorescent proteins in FFS studies non-fluorescent states are observed, which strongly affect molecular brightness analysis. Therefore, in this study a simple correction model was described, taking into account quantified non-fluorescent state fractions, to finally allow accurate and unbiased determination of oligomerization. This way it was shown, that NEP forms homo-dimers within the cytoplasm of cells, whereas a 2.5-fold lower homo-dimer population was observed in the nucleus. Combining the subcellular localization dependent oligomeric state of NEP and several NEP mutants with their localization phenotypes, a regulation mechanism was proposed in which the translocation of NEP is regulated by transient masking and unmasking of its two NESs, which is supported by dimerization in the cytoplasm and monomerization in the nucleus of cells, respectively.eng
dc.language.isoengnone
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin
dc.relation.haspart10.1038/s41598-018-28858-0
dc.rights(CC BY-NC-SA 3.0 DE) Namensnennung - Nicht-kommerziell - Weitergabe unter gleichen Bedingungen 3.0 Deutschlandger
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/de/
dc.subjectFluoreszenzfluktuationsspektroskopieger
dc.subjectMolecular brightness Analyseger
dc.subjectInfluenzavirusger
dc.subjectNukleusexportproteinger
dc.subjectFluorescence Fluctuation Spectroscopyeng
dc.subjectMolecular brightness analysiseng
dc.subjectInfluenza viruseng
dc.subjectNuclear export proteineng
dc.subject.ddc570 Biologienone
dc.subject.ddc530 Physiknone
dc.titleDissecting the protein interaction pattern of Influenza A virus nuclear export complex - A fluorescence fluctuation spectroscopy approachnone
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-110-18452/20750-8
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/19973
dc.date.accepted2019-04-09
dc.contributor.refereeVeit, Michael
dc.contributor.refereeChiantia, Salvatore
dc.contributor.refereeHerrmann, Andreas
dc.subject.rvkWF 4650
dc.subject.rvkYD 7263
dc.subject.rvkYD 6904
dc.subject.rvkYD 6912
dc.subject.rvkYD 6913
dc.subject.rvkWC 2600
dc.subject.rvkXD 7254
local.edoc.pages215none
local.edoc.type-nameDissertation
bua.departmentLebenswissenschaftliche Fakultätnone

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