Molekularbiologische Analyse der Diguanylatzyklase DgcE sowie weiterer biofilmrelevanter Proteine und Signale in Escherichia coli

Abstract

Für die E. coli K12 Biofilmbildung ist die Expression des Masterregulators CsgD essentiell. Dies erfordert das Signalmolekül c-di-GMP, dessen Auf- und Abbau durch 12 Diguanylatzyklasen (DGCs mit GGDEF-Domänen) und 13 Phosphodiesterasen (PDEs mit EAL-Domänen) erfolgt. DgcE ist mit einer MASE1-umfassenden Transmembranregion (TM), drei PAS-, einer GGDEF- und einer degenerierten EAL-Domäne die strukturell komplexeste DGC und notwendig für die Biofilmbildung. Diese Arbeit zeigt, dass die Aktivität von DgcE einer hoch komplexen Regulation unterliegt. Einzelnen DgcE-Domänen konnten aktivierende bzw. inhibierende Rollen hinsichtlich der Biofilmmatrixsynthese zugeordnet werden. Die Biofilmbildung hängt von DgcE-produziertem c-di-GMP ab, wobei die DgcE-Dimerisierung v.a. durch die PAS-Region vermittelt wird. Die EAL-Domäne wirkt einer aktiven DgcE-Form entgegen. Für die DgcE-vermittelte Matrixproduktion sind die GTPase YjdA und sein Partnerprotein YjcZ nötig. Über Interaktionen mit YjcZ und der TM von DgcE vermittelt YjdA eine Komplexbildung. Die Interaktion von YjdA und DgcE sowie die Matrixproduktion hängen von der GTPase-Aktivität von YjdA ab. GTP wird daher als intrazelluläres Signal vorgeschlagen, das die Aktivierung von DgcE durch YjdA/YjcZ reguliert. Die MASE1-umfassende TM agiert als Zentrale der Signalintegration. Einerseits ist sie nötig für die DgcE-Aktivität und andererseits ist sie an einem massiven Abbau von DgcE beteiligt. Zudem wurden neu identifizierte Curli-regulierende Gene (rbsK, rbsR, ydcI, yieP, puuR) untersucht, wobei keines über das PdeR/DgcM/MlrA-Modul in die c-di-GMP-vermittelte CsgD-Expression eingreift. Flagellare Verknotungen in der unteren Schicht von E. coli Makrokolonien tragen zur Morphogenese dieser Makrokolonien bei. Diese Arbeit zeigt, dass Flagellenverknotungen zu einer verminderten Expression der Master-PDE PdeH beitragen, wodurch vermutlich die zelluläre c-di-GMP-Konzentration steigt und somit die Biofilmbildung begünstigt wird.

Biofilm formation of E. coli K12 requires the expression of the biofilm master regulator CsgD. This process depends on the signaling molecule c-di-GMP, which is synthesized by 12 diguanylate cyclases (DGCs with GGDEF domains) and degraded by 13 phosphodiesterases (PDEs with EAL domains). DgcE is the most complex DGC with a MASE1-containing transmembrane region (TM), three PAS, a GGDEF and a degenerate EAL domain, and it is essential for biofilm formation. This work shows that the regulation of the DgcE activity is highly complex. It was possible to assign activating and inhibitory roles to single domains of DgcE with regard to the expression of biofilm matrix components. C-di-GMP produced by DgcE is necessary for biofilm matrix production. The dimerization of DgcE is mainly mediated by the PAS region, whereas the EAL domain counteracts an active form of DgcE. DgcE-mediated matrix synthesis requires the activating signal input of the GTPase YjdA and its partner protein YjcZ. DgcE, YjdA and YjcZ form a protein complex in which YjdA directly interacts with YjcZ and the TM of DgcE. The interaction between DgcE and YjdA as well as the matrix expression depend on the GTPase activity of YjdA. Thus, it is proposed that GTP serves as an intracellular signal regulating the activation of DgcE by YjdA/YjcZ. The MASE1-containing TM proved to be a central hub for signal integration. It is both required for DgcE activity and for a massive degradation of DgcE. Furthermore, newly discovered curli-regulating genes (rbsK, rbsR, ydcI, yieP, puuR) have been analyzed. None of those gene products act on CsgD expression via the PdeR/DgcM/MlrA module. Flagellar entangling within the bottom layer of E. coli macrocolonies determines morphogenesis of macrocolonies. The data presented here suggest that the master PDE PdeH is somehow down-regulated by flagellar entangling, which probably results in a higher cellular c-di-GMP concentration, thereby promoting biofilm formation.