Dynamics and variability of SMAD signaling in single cells- The activity of MAP kinases determines long-term dynamics of SMAD signaling

Abstract

Der TGFβ-Signalweg ist ein multifunktionales System, das zelluläre Prozesse reguliert, die von Proliferation und Migration bis zu Differenzierung und Zelltod reichen. Nach Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung translozieren SMAD-Proteine zum Zellkern und induzieren die Expression zahlreicher Zielgene. Während viele Komponenten des TGFβ-Signalweges identifiziert wurden, verstehen wir noch nicht genau, wie die Aktivierung des Signalwegs in verschiedene zelluläre Antworten übersetzt wird. Da die zelluläre Antwort auf einen gegebenen Stimulus oft sogar in genetisch identischen Zellen variiert, konzentrierte ich mich auf die Messung der Signalwegaktivität auf der Einzelzellebene. Durch die Kombination fluoreszierender Reporterzelllinien mit Zeitraffer-Lebendzellmikroskopie und automatisierter Bildanalyse beobachtete ich die zytoplasmatische und nukleäre Translokation von SMADs mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in Hunderten einzelner Zellen. Unsere Experimente zeigten, dass die Signalwegaktivität in eine erste synchrone Phase der SMAD-Translokation, gefolgt von einer Adaption und einer zweiten Signalphase mit hoher Variabilität in Stärke und Dauer der nuklearen Akkumulation unterteilt werden kann. Darüber hinaus beobachtete ich, dass Zellen, die aufgrund ihrer dynamischen Eigenschaften in Subpopulationen gruppiert sind, unterschiedliche phänotypische Reaktionen zeigen. Ich war nun daran interessiert, die Netzwerkinteraktionen zu identifizieren, die diese Dynamiken formen und fokussierte mich auf den Crosstalk mit nicht-kanonischen Komponenten des TGFβ-Signalweges. Ich konnte zeigen, dass die Hemmung der MAP Kinasen p38 und ERK die zweite Signalphase spezifisch aufhebt. Diese dynamische Remodellierung führt zu Veränderungen in der Zielgenexpression und den Zellschicksalen. Dies wird zu einem tieferen Verständnis der molekularen Netzwerke führen, die die TGFβ-Signaltransduktion regulieren und Möglichkeiten eröffnen, es in erkrankten Zellen zu modulieren.

The TGFβ pathway is a multi-functional signaling system regulating cellular processes ranging from proliferation and migration to differentiation and cell death. Upon ligand binding and receptor activation, SMAD proteins translocate to the nucleus and induce expression of numerous target genes. While many components of the TGFβ pathway have been identified, we are still challenged to understand how pathway activation is translated into distinct cellular responses. As the cellular response to a given stimulus often varies even in genetically identical cells, I focused on measuring pathway activity on the single cell level. By combining fluorescent reporter cell lines with time-lapse live-cell microscopy and automated image analysis, I monitored the cytoplasmic to nuclear translocation of SMADs with high temporal and spatial resolution in hundreds of individual cells. Our experiments demonstrated that pathway activity can be divided into a first synchronous phase of SMAD translocation, followed by adaptation and a second signaling phase with high variability in the extent and duration of nuclear accumulation. Furthermore, I observed that cells clustered into subpopulations according to their dynamic features show different phenotypic responses. I was interested in identifying the network interactions that shape these dynamics and focus on crosstalk with non-canonical components of the TGFβ pathway. I could show that inhibition of the MAP kinases p38 and ERK specifically abrogates the second signaling phase. This dynamic remodeling led to changes in target gene expression and cell fate decisions. I explored the molecular mechanisms underlying this interaction of the canonical and non-canonical pathways. This will provide a deeper understanding of the molecular networks regulating TGFβ signaling and open opportunities to modulate it in diseased cells.