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2020-07-29Dissertation DOI: 10.18452/21617
Molekularer Mechanismus protonenleitender Kanalrhodopsine und protonengekoppelte Zwei-Komponenten-Optogenetik
dc.contributor.authorVierock, Johannes Tobias Theodor
dc.date.accessioned2020-07-29T09:12:19Z
dc.date.available2020-07-29T09:12:19Z
dc.date.issued2020-07-29none
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/22365
dc.description.abstractKanalrhodopsine (ChRs) sind lichtaktivierte Ionenkanäle motiler Algen. Heterolog exprimiert erlauben sie es, Ionenflüsse durch Licht zu steuern. Bevorzugt geleitet werden von den meisten ChRs Protonen. Ausprägung und Wirkung lichtaktivierter Protonenflüsse sowie der molekulare Mechanismus protonenselektiver ChRs werden in vorliegender Arbeit untersucht und zur Entwicklung neuer optogenetischer Werkzeuge genutzt. Eine besonders hohe Protonenselektivität zeigten die grün- und rotlicht-aktivierten Kanäle CsChR und Chrimson aus den Algen Chloromonas subdivisa und Chlamydomonas noctigama. Im spektroskopisch detailliert untersuchten CrChR2 aus Chlamydomonas reinhardtii änderte sich die Protonenselektivität nach Anregung mit einem ns-Laserblitz sogar innerhalb eines Aktivierungszyklus und war insbesondere nach Öffnung des Kanals sowie in Folge der Lichtadaptation hoch. Als unentbehrlich für eine effiziente Protonenleitung erwiesen sich in allen drei Kanälen konservierte, titrierbare Reste entlang der Pore, deren individuelle Bedeutung für die Protonenleitung sich je nach Protein wesentlich unterschied. Entsprechend genügte in Chrimson der Austausch einzelner Glutaminsäuren des extrazellulären Halbkanals, dieses in einen grün- oder rotlichtaktivierten Natriumkanal zu transformieren. Aminosäuresubstitutionen der unmittelbaren Retinalumgebung verschoben hingegen das Aktionsmaximum von Chrimson röter als 600 nm und damit röter als in allen bisher beschriebenen ChRs. In Chrimson versperrt hierbei ein zusätzliches äußeres Tor den extrazellulär Halbkanal, während die Retinalbindetasche in Struktur und funktionaler Bedeutung der einzelnen Reste wesentlich jener der Protonenpumpe Bacteriorhodopsin ähnelt. Als Zwei-Komponenten-Optogenetik wurden schließlich protonen-, kationen- und anionenleitende ChRs unterschiedlicher Farbsensitivität fusioniert sowie lichtgetriebene Protonenpumpen mit protonenaktivierten Ionenkanälen kombiniert und neue optogenetische Perspektiven eröffnet.ger
dc.description.abstractChannelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels from green algae. Expressed in host cells they are used to control ion fluxes by light and are widely applied in Neurosciences. Although generally classified as either cation or anion channels, most ChRs preferentially conduct protons. This thesis compares proton conductance of different ChRs, examines the molecular mechanism of proton selective ChRs and explores the usage of light regulated proton fluxes in two-component-optogenetics. Proton selectivity varied strongly among different ChRs and was most pronounced for the green- and red-light activated channels CsChR and Chrimson from the algae Chloromonas subdivisa and Chlamydomonas noctigama, that conducted predominantly protons even at high pH. In CrChR2 from Chlamydomonas reinhardtii proton selectivity also changed during a single activation cycle and was especially high directly after channel opening and later on following light adaptation. In all three channels efficient proton conductance depended on conserved titratable residues along the pore with different contribution of the individual side chains in each protein. The substitution of single glutamic acids in the extracellular half pore converted Chrimson into a green or red-light activated sodium channel. A single point mutation close to the retinal chromophore shifted peak absorption of Chrimson beyond 600 nm - further red than all other cation conducting ChRs. Whereas the retinal binding pocket of Chrimson resembles the proton pump Bacteriorhodpsin, the overall pore structure corresponds to other ChRs, but features an additional outer gate, that occludes the extracellular half pore and is important for both, proton selectivity and red light absorption. Finally different Two-Component-Optogenetic approaches combined proton and anion selective ChRs of distinct colour as well as light-driven proton pumps and proton-activated ion channels with major prospect for future optogenetic applications.eng
dc.language.isogernone
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin
dc.rights(CC BY-NC-ND 4.0) Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internationalger
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subjectKanalrhodopsinger
dc.subjectOptogenetikger
dc.subjectZwei-Komponenten-Optogenetikger
dc.subjectProtonenkanalger
dc.subjectProtonenselektivitätger
dc.subjectFarbanpassungger
dc.subjectmikrobielle Rhodopsineger
dc.subjectChrimsonger
dc.subjectPhotozyklusger
dc.subjectElektrophysiologieger
dc.subjectpH-Bildgebungger
dc.subjectCsChRger
dc.subjectChannelrhodopsineng
dc.subjectOptogeneticseng
dc.subjectTwo-Component-Optogeneticseng
dc.subjectProton channeleng
dc.subjectproton selectivityeng
dc.subjectcolor tuningeng
dc.subjectmicrobial rhodopsinseng
dc.subjectChrimsoneng
dc.subjectphotocycleeng
dc.subjectelectrophysiologyeng
dc.subjectpH-imagingeng
dc.subjectCsChReng
dc.subject.ddc572 Biochemienone
dc.subject.ddc570 Biologienone
dc.subject.ddc535 Licht und verwandte Strahlungnone
dc.subject.ddc530 Physiknone
dc.titleMolekularer Mechanismus protonenleitender Kanalrhodopsine und protonengekoppelte Zwei-Komponenten-Optogenetiknone
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-110-18452/22365-2
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/21617
dc.date.accepted2019-08-29
dc.contributor.refereeHegemann, Peter
dc.contributor.refereeBartl, Franz
dc.contributor.refereeFriedrich, Thomas
dc.subject.rvkWD 2800
dc.subject.rvkWD 2200
local.edoc.pages239none
local.edoc.type-nameDissertation
local.edoc.institutionLebenswissenschaftliche Fakultätnone

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