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2020-11-06Dissertation DOI: 10.18452/21903
Gen-Editierung von Photorezeptorgenen in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems
dc.contributor.authorKelterborn, Simon
dc.date.accessioned2020-11-06T11:32:53Z
dc.date.available2020-11-06T11:32:53Z
dc.date.issued2020-11-06none
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/22774
dc.description.abstractDie Modifikation von Genen ist in den molekularen Biowissenschaften ein fundamentales Werkzeug, um die Funktion von Genen zu studieren (Reverse Genetik). Diese Arbeit hat erfolgreich Zinkfinger- und CRISPR/Cas9-Nukleasen für die Verwendung in C. reinhardtii etabliert, um Gene im Kerngenom gezielt auszuschalten und präzise zu verändern. Basierend auf vorausgegangener Arbeit mit Zinkfingernukleasen (ZFN) konnte die Transformationseffizienz um das 300-fache verbessert werden, was die Inaktivierung von Genen auch in motilen Wildtyp-Zellen ermöglichte. Damit war es möglich, die Gene für das Kanalrhodopsin-1 (ChR1), Kanalrhodopsin-2 (ChR2) und das Chlamyopsin-1/2-Gen (COP1/2) einzeln und gemeinsam auszuschalten. Eine Analyse der Phototaxis in diesen Stämmen ergab, dass die Phototaxis durch Inaktivierung von ChR1 stärker beeinträchtigt ist als durch Inaktivierung von ChR2. Um das CRISPR/Cas9-System zu verwenden, wurden die Transformationsbedingungen so angepasst und optimiert, dass der Cas9-gRNA-Komplex als in vitro hergestelltes Ribonukleoprotein in die Zellen transformiert wurde. Um die Bedingungen für präzise Genmodifikationen zu messen und zu verbessern, wurde das SNRK2.2-Gen als Reportergen für eine „Blau-Grün Test“ etabliert. Kleine Insertionen von bis zu 30 bp konnten mit kurzen Oligonukleotiden eingefügt werden, während größere Reportergene (mVenus, SNAP-Tag) mithilfe eines Donor-Plasmids generiert wurden. In dieser Arbeit konnten mehr als 20 nicht-selektierbare Gene – darunter 10 der 15 potenziellen Photorezeptorgene – mit einer durchschnittlichen Mutationsrate von 12,1 % inaktiviert werden. Insgesamt zeigt diese Arbeit in umfassender Weise, wie Gen-Inaktivierungen und Modifikationen mithilfe von ZFNs und des CRISPR/Cas9-Systems in der Grünalge C. reinhardtii durchgeführt werden können. Außerdem bietet die Sammlung der zehn Photorezeptor-Knockouts eine aussichtsreiche Grundlage, um die Vielfalt der Photorezeptoren in C. reinhardtii zu erforschen.ger
dc.description.abstractGene editing is a fundamental tool in molecular biosciences in order to study the function of genes (reverse genetics). This study established zinc-finger and CRISPR/Cas9 nucleases for gene editing to target and inactivate the photoreceptor genes in C. reinhardtii. In continuation of previous work with designer zinc-finger nucleases (ZFN), the transformation efficiency could be improved 300-fold, which enabled the inactivation of genes in motile wild type cells. This made it possible to disrupt the Channelrhodopsin-1 (ChR1), Channelrhodopsin-2 (ChR2) and Chlamyopsin-1/2 (COP1/2) genes individually and in parallel. Phototaxis experiments in these strains revealed that the inactivation of ChR1 had a greater effect on phototaxis than the inactivation of ChR2. To apply the CRISPR/Cas9 system, the transformation conditions were adapted and optimized so that the Cas9-gRNA complex was successfully electroporated into the cells as an in vitro synthesized ribonucleoprotein. This approach enabled gene inactivations with CRISPR/Cas9 in C. reinhardtii. In order to measure and improve the conditions for precise gene modifications, the SNRK2.2 gene was established as a reporter gene for a ‘Blue-Green test’. Small insertions of up to 30 bp were inserted using short oligonucleotides, while larger reporter genes (mVenus, SNAP-tag) were integrated using donor plasmids. Throughout this study, more than 20 non-selectable genes were disrupted, including 10 of the photoreceptor genes, with an average mutation rate of 12,1 %. Overall, this work shows in a comprehensive way how gene inactivations and modifications can be performed in green alga C. reinhardtii using ZFNs or CRISPR/Cas9. In addition, the collection of the ten photoreceptor knockouts provides a promising source to investigate the diversity of photoreceptor genes in C. reinhardtii.eng
dc.language.isogernone
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin
dc.rights(CC BY 4.0) Attribution 4.0 Internationalger
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
dc.subjectCRISPRger
dc.subjectCas9ger
dc.subjectChlamydomonasger
dc.subjectreinhardtiiger
dc.subjectGrünalgenger
dc.subjectGen-Editierungger
dc.subjectPhotorezeptorenger
dc.subjectChR1ger
dc.subjectChR2ger
dc.subjectChlamyopsinger
dc.subjectHDRger
dc.subjectSNRK2.2ger
dc.subjectZFNger
dc.subjectgene editingeng
dc.subjectalgaeeng
dc.subjectphotoreceptoreng
dc.subjectchannelrhodopsineng
dc.subjectgene targetingeng
dc.subjecthomologous recombinationeng
dc.subjectzinc-finger nucleaseseng
dc.subject.ddc570 Biologienone
dc.subject.ddc579 Naturgeschichte von Mikroorganismen, Pilzen, Algennone
dc.subject.ddc576 Genetik und Evolutionnone
dc.titleGen-Editierung von Photorezeptorgenen in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii mithilfe des CRISPR/Cas9-Systemsnone
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-110-18452/22774-4
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/21903
dc.date.accepted2020-06-08
dc.contributor.refereeHegemann, Peter
dc.contributor.refereeSchmitz-Linneweber, Christian
dc.contributor.refereeNickelsen, Jörg
dc.subject.rvkWL 2795
dc.subject.rvkWE 5220
dc.subject.rvkWC 4460
local.edoc.pages150none
local.edoc.type-nameDissertation
local.edoc.institutionLebenswissenschaftliche Fakultätnone

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