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2021-02-12Dissertation DOI: 10.18452/22287
Chemical Approaches to Elucidate Lysine Phosphorylation
dc.contributor.authorHauser, Anett
dc.date.accessioned2021-02-12T08:12:20Z
dc.date.available2021-02-12T08:12:20Z
dc.date.issued2021-02-12none
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/23091
dc.description.abstractReversible Phosphorylierung ist die bekannteste posttranslationale Modifikation (PTM) und die O-Phosphomonoester von Serin, Threonin und Tyrosin galten lange als die einzigen relevanten Vertreter. Vor kurzem wurden erste Erkenntnisse über die biologische Relevanz von labilen Phosphorylierungen veröffentlicht, z.B. die Phosphorylierung von Histidin, Arginin und Cystein sowie die Pyrophosphorylierung von Serin und Threonin. Auch die Aufklärung von Phospho-Lysin (pLys) wurde mit der Etablierung einer chemoselektiven Synthese zur Darstellung ortsselektiv phosphorylierter Lysinpeptide und der Entwicklung massenspektrometrischer Protokolle zur eindeutigen pLys-Identifizierung in Angriff genommen. Dennoch wurde bisher kein endogenes pLys beschrieben oder eingehende Untersuchungen mit interagierenden Enzymen durchgeführt. In dieser Arbeit werden mehrere Ansätze zur Erweiterung des Wissens über pLys vorgestellt. Dazu gehören das Design einer alternativen Syntheseroute zu pLys-Peptiden und die Entwicklung sowie Evaluierung von zwei stabilen Analoga als Bausteine für die Peptidsynthese. Weiterhin wurde die Protonierung des Phosphoramidatstickstoffs untersucht. In systematischen Enzymaktivitätsassays wurden die Wechselwirkungen zwischen Phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) und verschiedenen Phospho-Substraten untersucht. Dabei zeigte sich eine ausgeprägte Selektivität für pLys, eine hohe Sequenzabhängigkeit der LHPP-Aktivität und ein klares Bindungsmotiv. Darüber hinaus wurden proteomische Methoden hinsichtlich ihrer Eignung für pLys-Peptide evaluiert. Im Laufe dieser Untersuchung wurden mehrere pLys-Immunogene für die Generierung von monoklonalen anti-pLys-Antikörpern und ein Workflow für die Histontrennung und -analyse entwickelt. Des Weiteren wurde die chelationsverstärkte Fluoreszenz von markierten Phospho-Peptiden als Werkzeug zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrades in Enzymaktivitäts- oder Stabilitätsassays untersucht.ger
dc.description.abstractReversible phosphorylation is the most prominent post-translational modification (PTM) and the O-phosphomonoesters of serine, threonine and tyrosine have been considered as the only notable forms for long time. Recent developments have paved the way to insights into the biological relevance of labile phosphorylations, e.g. phosphorylation of histidine, arginine and cysteine as well as pyrophosphorylation of serine and threonine. Also, the elucidation of phospho-lysine (pLys) was tackled with the establishment of a chemoselective synthesis to obtain site-selectively phosphorylated lysine peptides and the development of mass spectrometric protocols to unambiguously identify modification sites. Nonetheless, no endogenous pLys site has been described or in-depth investigations of interacting enzymes have been conducted. In this thesis, several approaches to enhance the knowledge about pLys are introduced. These include the design of an alternative synthesis route to pLys peptides and the development as well as evaluation of two stable analogues as building blocks for peptide synthesis. Furthermore, the protonation of the phosphoramidate-nitrogen was investigated. In systematic phosphoramidate hydrolase and phosphatase activity assays, the interactions between phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) and various phospho-substrates were examined. Thereby, distinct selectivity for pLys, high sequence dependence of LHPP activity and a distinct binding motif were revealed. In addition to that, proteomic methods were evaluated regarding their suitability for pLys peptides. Over the course of this investigation, several pLys immunogens for the generation of monoclonal anti-pLys antibodies and a workflow for histone separation and analysis were developed. Furthermore, chelation-enhanced fluorescence of labeled phospho-peptides was studied as a tool for determining the degree of phosphorylation in enzyme activity or stability assays.eng
dc.language.isoengnone
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin
dc.relation.haspart10.1039/D0SC03930F
dc.relation.haspart10.1002/chem.202003947
dc.rights(CC BY-NC-ND 4.0) Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internationalger
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subjectposttranslationale Modifikationger
dc.subjectlabile Phosphorylierungger
dc.subjectPhospho-Lysinger
dc.subjectchemoselektive Reaktionenger
dc.subjectbiochemische Assaysger
dc.subjectpost-translational modificationeng
dc.subjectphospho-lysineeng
dc.subjectchemoselective reactionseng
dc.subjectbiochemical assayseng
dc.subjectlabile phosphorylationeng
dc.subject.ddc540 Chemie und zugeordnete Wissenschaftennone
dc.subject.ddc547 Organische Chemienone
dc.titleChemical Approaches to Elucidate Lysine Phosphorylationnone
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-110-18452/23091-7
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/22287
dc.date.accepted2020-10-27
dc.contributor.refereeHackenberger, Christian P. R.
dc.contributor.refereeFiedler, Dorothea
dc.contributor.refereeHedberg, Christian
local.edoc.pages271none
local.edoc.type-nameDissertation
local.edoc.institutionMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultätnone

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