Towards functional assignment of Plasmodium membrane transport proteins: an experimental genetics study on four diverse proteins

Abstract

Etliche Membran Transport Proteine (MTP) sind essentiell in den Plasmodium Blutstadien, und geraten zunehmend in den Fokus der Wirkstoffentwicklung. Die physiologischen Rollen der Transporter sind jedoch oft ungeklärt. In dieser Arbeit wurden mittels experimenteller Genetik funktionelle Charakteristika der MTPs untersucht. Am Maus Parasiten Plasmodium berghei und der Plasmodium falciparum Blutstadien-Kultur wurden vier MTPs ausgewählt: ein konservierter Folat Transporter (FT2), sowie eine P. falciparum-spezifisches P-Typ ATPase und zwei essentielle MTPs (CRT und ATP4). Diese Auswahl verkörpert ein breites Spektrum an MTP Kandidaten und reflektieren zudem das Potenzial und die Grenzen funktioneller Analysen von Plasmodium MTPs mittels reverser Genetik. Für den Folat Transporter 2 (FT2) wurde eine Kombination von transgenen Strategien auf P. berghei angewandt. Durch ein endogenes tag von FT2 wurde die Lokalisierung im Apicoplast, sowie dessen Expression über fast den kompletten Zyklus hinweg gezeigt. Nach der Deletion von FT2, wiesen die Parasiten einen Defekt während der Sporulation auf. Demzufolge bilden sich nur nicht infektiöse Sporozoiten, was letztendlich zur Unterbrechung des Lebenszyklus der Parasiten führt. Eine Aminophospholipid P-Typ ATPase, wurde mittels CRISPR/Cas9 in P. falciparum genetisch deletiert und die Mutante analysiert. Im Gegensatz zu den meisten vitalen P-Typ ATPasen erweist sich das Gen in den asexuellen Blutstadien als entbehrlich. Des Weiteren bilden die MTPs ATP4 und CRT einen einflussreichen Faktor bei Malaria-Therapien. Eine umfassende Analyse von räumlichen und zeitlichen Expressionsmustern von transgenen Parasiten mit mCherry-getaggten Proteinen zeigt ein Expression der beiden MTPs über die Blutstadien hinaus, was auf zusätzliche Funktionen in den jeweiligen Stadien verweist. Diese Studie trägt, basierend auf Lokalisation, Expression und funktioneller Deletion, zur funktionellen Entschlüsselung der vier untersuchten MTPs bei.

Many membrane transport proteins (MTP) are essential for Plasmodium infection and gain importance as candidate drug targets in malaria therapy, whereas the physiological functions often remain enigmatic. In this thesis, we applied experimental genetics to determine key characteristics of four Plasmodium MTPs. We employed the murine malaria model parasite Plasmodium berghei and in vitro blood cultures of Plasmodium falciparum. We selected one conserved MTP called FT2, which was previously shown to transport folate, a P-type ATPase that is specific for P. falciparum as well as two essential MTPs, CRT and ATP4. These targets exemplify the range of druggable candidates and illustrate the potential and limitations of reverse genetics to decipher their physiological roles. A combination of transgenic and knockout strategies was applied to the P. berghei folate transporter 2 (FT2). We show that endogenously tagged FT2 localises to the apicoplast membranes, and is broadly expressed throughout the parasite’s life cycle. Analysis of FT2-deficient parasites revealed a severe sporulation defect in the vector; the vast majority of ft2– oocysts form large intracellular vesicles which displace the cytoplasm. Very few sporozoites are generated and these are non-infectious to the mammalian host, resulting in a complete arrest of Plasmodium transmission. A candidate aminophospholipid P-type ATPase, was assessed by a CRISPR/Cas9-mediated gene disruption. Compared to many vital P-type ATPases this gene is dispensable for asexual blood replication. Two MTPs, ATP4 and CRT are prime targets for antimalarial therapies. A comprehensive spatio-temporal expression analysis of transgenic parasites expressing mCherry-tagged proteins revealed expression beyond blood infection, indicative of functions in additional parasite stages. The findings of this study contribute towards a better understanding of the roles of the four MTPs based on localisation, expression and functional deletion.