Parallel Genetics of Gene Regulatory Sequences in Caenorhabditis elegans

Abstract

Wie regulatorische Sequenzen die Genexpression steuern, ist von grundlegender Bedeutung für die Erklärung von Phänotypen in Gesundheit und Krankheit. Die Funktion regulatorischer Sequenzen muss letztlich in ihrer genomischen Umgebung und in entwicklungs- oder gewebespezifischen Zusammenhängen verstanden werden. Da dies eine technische Herausforderung ist, wurden bisher nur wenige regulatorische Elemente in vivo charakterisiert. Hier verwenden wir Induktion von Cas9 und multiplexed-sgRNAs, um hunderte von Mutationen in Enhancern/Promotoren und 3′ UTRs von 16 Genen in C. elegans zu erzeugen. Wir quantifizieren die Auswirkungen von Mutationen auf Genexpression und Physiologie durch gezielte RNA- und DNA-Sequenzierung. Bei der Anwendung unseres Ansatzes auf den 3′ UTR von lin-41, bei der wir hunderte von Mutanten erzeugen, stellen wir fest, dass die beiden benachbarten Bindungsstellen für die miRNA let-7 die lin-41-Expression größtenteils unabhängig voneinander regulieren können, mit Hinweisen auf eine mögliche kompensatorische Interaktion. Schließlich verbinden wir regulatorische Genotypen mit phänotypischen Merkmalen für mehrere Gene. Unser Ansatz ermöglicht die parallele Analyse von genregulatorischen Sequenzen direkt in Tieren.

How regulatory sequences control gene expression is fundamental for explaining phenotypes in health and disease. The function of regulatory sequences must ultimately be understood within their genomic environment and development- or tissue-specific contexts. Because this is technically challenging, few regulatory elements have been characterized in vivo. Here, we use inducible Cas9 and multiplexed guide RNAs to create hundreds of mutations in enhancers/promoters and 3′ UTRs of 16 genes in C. elegans. We quantify the impact of mutations on expression and physiology by targeted RNA sequencing and DNA sampling. When applying our approach to the lin-41 3′ UTR, generating hundreds of mutants, we find that the two adjacent binding sites for the miRNA let-7 can regulate lin-41 expression largely independently of each other, with indications of a compensatory interaction. Finally, we map regulatory genotypes to phenotypic traits for several genes. Our approach enables parallel analysis of gene regulatory sequences directly in animals.