Plasticity and Therapeutic Potential of cAMP and cGMP-specific Phosphodiesterases in Toxoplasma gondii

Abstract

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulärer protozoischer Parasit, der Toxoplasmose beim Menschen und bei Warmblütern verursacht. Die Signalübertragung durch zyklische Nukleotide ist entscheidend für das erfolgreiche intrazelluläre Überleben und die Vermehrung der Parasiten. Hier haben wir die physiologische und biochemische Bedeutung der wesentlichen Phosphodiesterasen (PDEs) in Toxoplasma gondii Tachyzoiten untersucht. Durch C-terminale Markierung von 18 PDEs konnten wir die Expression von 11 PDEs nachweisen. Die Immunogold-Färbung zeigte, dass TgPDE1, TgPDE2 und TgPDE9 im gesamten Parasitenkörper verteilt sind, einschließlich des inneren Membrankomplexes, des apikalen Pols, der Plasmamembran, des Zytosols, der dichten Granula und der Rhoptry, was auf eine räumliche Kontrolle der Signalübertragung innerhalb der Tachyzoiten hindeutet. Anschließend stellten wir fest, dass die meisten Enzyme berüchtigte dual-spezifische Phosphodiesterasen sind, wobei TgPDE2 anders als T.gondii cAMP-spezifisch ist, während T.gondii keine cGMP-spezifische Phosphodiesterase besitzt. Unsere enzymkinetischen Daten zeigen, dass TgPDE2 die höchste Affinität zu seinem Substrat aufweist, während die dualen PDEs (TgPDE1, TgPDE7 und TgPDE9) eine höhere Affinität zu cGMP als zu cAMP haben. Ein Screening der Hemmung gängiger PDE-Inhibitoren auf TgPDEs ergab, dass TgPDE1 das Ziel von BIPPO und Zaprinast ist. Darüber hinaus ergab die biologische Bedeutung, dass TgPDE1 und TgPDE2 einzeln für das Wachstum des Parasiten notwendig sind und ihr Verlust zum Tod des Parasiten führt, was auf ihre funktionelle Redundanz hindeutet. Darüber hinaus identifizierten wir Kinasen und Phosphatasen innerhalb der TgPDE1- und TgPDE2-Interaktome, die die enzymatische Aktivität über Protein-Protein-Interaktionen oder posttranslationale Modifikationen steuern könnten. Insgesamt unterstreichen unsere Erkenntnisse über die subzelluläre Lokalisierung, die katalytische Funktion, die medikamentöse Hemmung und die physiologische Bedeutung der wichtigsten Phosphodiesterasen die unvorhersehbare Plastizität und das therapeutische Potenzial der zyklischen Nukleotid-Signalübertragung in T. gondii. Der Datensatz der cAMP-bindenden Interaktoren, den wir in einem anderen Aspekt dieser Studie offengelegt haben, wird wertvolle Einblicke in die allgegenwärtige Natur der cAMP-vermittelten Signalübertragung in T. gondii Tachyzoiten liefern.

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite that causes toxoplasmosis in human and warm-blood organisms. Cyclic nucleotide signaling is crucial for the successful intracellular survival and replication of the parasites. Here, we dissected the physiological and biochemical importance of the essential phosphodiesterases (PDEs) in Toxoplasma gondii tachyzoite. By C-terminal tagging of 18 PDEs, we detected the expression of 11 PDEs. Immunogold staining revealed that TgPDE1, TgPDE2 and TgPDE9 are distributed throughout the parasite body, including the inner membrane complex, the apical pole, the plasma membrane, the cytosol, dense granules, and rhoptry, suggesting the spatial control of signaling within tachyzoites. Subsequently, we identified that most enzymes are notorious dual-specific phosphodiesterases, and TgPDE2 is cAMP specific differently, whilst T.gondii lacks of cGMP specific phosphodiesterase. Our enzyme kinetic data demonstrated that the highest affinity to its substrate belongs to TgPDE2, while the dual PDEs (TgPDE1, TgPDE7 and TgPDE9) have higher affinity with cGMP than cAMP. Inhibition screening of commonly-used PDE inhibitors on TgPDEs, signifying TgPDE1 as the target of BIPPO and zaprinast. Furthermore, the biological significance revealed TgPDE1 and TgPDE2 are individually necessary for parasite growth, and their loss associatively results in parasite death, implying their functional redundancy. In addition, we identified kinases and phosphatases within the TgPDE1 and TgPDE2 interactomes, which may operate the enzymatic activity via protein-protein interactions or posttranslational modifications. Collectively, our findings on subcellular localization, catalytic function, drug inhibition, and physiological relevance of major phosphodiesterases highlight the unforeseeable plasticity and therapeutic potential of cyclic nucleotide signaling in T. gondii. The data set of cAMP-binding interactors, which we disclosed in another aspect of this study, will provide valuable insight into the pervasive nature of cAMP-mediated signaling in T. gondii tachyzoites.