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2023-05-12Dissertation DOI: 10.18452/26386
Dual Dye-Enhanced FIT2 Probes for Sequence-Specific Detection of RNA
dc.contributor.authorSchöllkopf, Sophie
dc.date.accessioned2023-05-12T06:22:51Z
dc.date.available2023-05-12T06:22:51Z
dc.date.issued2023-05-12none
dc.identifier.urihttp://edoc.hu-berlin.de/18452/27222
dc.description.abstractDie Fähigkeit Nukleinsäuren in lebenden Organismen nachzuweisen und zu visualisieren, ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Prozesse. Die Forschungsgruppe von Prof. Dr. Oliver Seitz hat zu diesem Zweck fluorogene FIT-Hybridisierungssonden entwickelt, die die besondere Eigenschaft der Cyaninfarbstoffe Thiazolorange und Chinolinblau nutzen, stärker zu fluoreszieren, wenn sie in die beengte Umgebung eines Nukleinsäureduplex aus Sonde und spezifischer Zielsequenz eingebracht werden. Obwohl FIT-Sonden eine gute Fluoreszenzverstärkung und Spezifität aufweisen, wäre eine weitere Verbesserung ihrer Helligkeit und des Signal-Hintergrund-Verhältnisses wünschenswert. Um dies zu erreichen, wurde in dieser Arbeit ein Ansatz untersucht, bei dem FIT-Sonden mit zwei Fluorophoren desselben Typs ausgestattet werden (FIT2-Strategie). Dies sollte sowohl die Helligkeit der Sonde erhöhen, als auch die Fluoreszenz im Einzelstrang und bei Hybridisierung mit fehlgepaarter RNA durch eine Mischung aus kontaktvermittelter Fluo-reszenzlöschung und strahlungsfreiem Energietransfer verringern. Verschiedene Sonden-längen, Farbstoffabstände und -positionen wurden untersucht und es konnte bestätigt werden, dass FIT2-Sonden eine höhere Extinktionskoeffizienten, größere Fluoreszenzver-stärkung und eine bessere Selektivität aufweisen als einfach markierte Sonden. Außerdem behalten sie ihre Fähigkeit zur Unterscheidung von Match- und Mismatch-Zielen in visko-sem Zelllysat besser bei. Zudem konnte gezeigt werden, dass das FIT2-Konzept durch Hinzufügen eines hybridisie-rungsunempfindlichen Cyanin 7 Farbstoffs zu den Sonden dahingehend erweitert werden kann, dass eine ratiometrische Detektion der hybridisierten Sonde möglich ist und Hellig-keitsunterschiede aufgrund von lokalen Schwankungen der Sondenkonzentration bei der Bildgebung lebender Zellen korrigiert werden können. Mit diesen qFIT2-Sonden konnten Jurkat und CCRF-CEM T-Zellen in einem Mikroskopie-basierten Experiment unterschieden werden.ger
dc.description.abstractThe ability to detect and visualize nucleic acids in living organisms is crucial for under-standing cellular processes. For this purpose, the research group of Prof. Dr. Oliver Seitz has introduced fluorogenic forced intercalation (FIT) hybridization probes, which exploit the unique property of the cyanine dyes thiazole orange and quinoline blue to exhibit increased fluorescence when placed in the constrained environment of a nucleic acid du-plex formed between probe and specific target sequence. Although FIT probes demon-strate solid fluorescence enhancement and specificity, further improvement of their abso-lute brightness and signal-to-background ratio would be desirable. To achieve this, the present thesis investigated an approach that equips FIT probes with two identical fluorophores (FIT2 strategy). This should on the one hand increase probe brightness, while simultaneously reducing fluorescence in the single strand and when hy-bridized to mismatched RNA, through a combination of contact-mediated quenching and non-radiant energy transfer. Various probe lengths, dye-dye distances and positions were screened, and it could be confirmed that FIT2 probes have higher extinction coefficients, greater fluorescence enhancement and better selectivity than their mono-dye counter-parts. Moreover, they better retain their ability to discriminate match and mismatch tar-gets in viscous cell lysate. Finally, it was demonstrated that the FIT2 concept can be extended by adding a hybridiza-tion-insensitive Cyanine 7 dye to the probes, allowing ratiometric detection of hybridized probe and correction of brightness differences due to local fluctuations in probe concen-tration during live-cell imaging. Using these qFIT2 probes, Jurkat and CCRF-CEM T-cells could be distinguished in a microscopy-based experiment.eng
dc.language.isoengnone
dc.publisherHumboldt-Universität zu Berlin
dc.rights(CC BY-NC 4.0) Attribution-NonCommercial 4.0 Internationalger
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
dc.subjectRNA Detektionger
dc.subjectHybridisierungssondenger
dc.subjectErzwungene Interkalationger
dc.subjectThiazol Orangeger
dc.subjectQuinolin Blauger
dc.subjectSelbst-Löschungger
dc.subjectRNA detectioneng
dc.subjecthybridisation probeseng
dc.subjectforced intercalationeng
dc.subjectthiazol orangeeng
dc.subjectquinoline blueeng
dc.subjectself-quenchingeng
dc.subject.ddc572 Biochemienone
dc.titleDual Dye-Enhanced FIT2 Probes for Sequence-Specific Detection of RNAnone
dc.typedoctoralThesis
dc.identifier.urnurn:nbn:de:kobv:11-110-18452/27222-3
dc.identifier.doihttp://dx.doi.org/10.18452/26386
dc.date.accepted2023-02-20
dc.contributor.refereeSeitz, Oliver
dc.contributor.refereeHackenberger, Christian
dc.contributor.refereeWagenknecht, Hans-Achim
local.edoc.pages197none
local.edoc.type-nameDissertation
dc.relation.issupplementedby10.1039/D3SC00363A
bua.departmentMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultätnone

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