Detection and characterization of Huntingtin-protein interactions using resonance energy transfer methodologies

Abstract

HTT ist ein Protein, das durch seine Verbindung mit mehreren Interaktionspartnern an einer Vielzahl von zellulären Prozessen beteiligt ist. Darüber hinaus verursacht eine Mutation im HTT-Gen eine Krankheit, die als Huntington-Krankheit (HD) bezeichnet wird. Aufgrund der gerüstbildenden Eigenschaften von HTT wurde eine Vielzahl von Studien durchgeführt, um potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Die auf dem Resonanzenergietransfer (RET) basierenden Ansätze sind jedoch im Bereich der Huntington-Krankheit noch nicht vollständig genutzt worden. Daher habe ich versucht, solche Ansätze in Interaktionsstudien mit dem HTT-Exon 1 (HTTexon1) und dem Protein in voller Länge zu bewerten. Ich habe eine Benchmarking-Studie mit einem zuvor beschriebenen Huntingtin-interagierenden Protein (HIP) und HTTex1 (Wildtyp und mutiert) unter Verwendung eines BRET-Ansatzes durchgeführt. Meine Studien bestätigten die binäre Interaktion zwischen HTTex1 und sieben Proteinen. Ich habe auch drei Interaktionen mit der mutierten Version von HTTex1 bestätigt. Zusätzlich bewertete ich die Interaktionen durch FRET-Messungen mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Der zweite Teil dieser Arbeit zielte darauf ab, ein Hochdurchsatz-Screening für den Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) mit HTT in voller Länge (FL) unter Verwendung von Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer zu etablieren. Auf diese Weise konnte ich die Wechselwirkung zwischen FL HTT und einer Bibliothek von 580 Proteinkinasen bewerten. Schließlich analysierte ich die Spezifität der entdeckten Wechselwirkungen, indem ich die unspezifische Bindung durch Donor-Sättigungstests bewertete. Zusammenfassend belegen meine Ergebnisse die potenzielle Verwendung von Resonanzenergietransferansätzen zur Validierung von HTT-Wechselwirkungen. Außerdem wird ein neues Screening-Tool vorgestellt, das dazu beitragen soll, HTT-Interaktoren zu identifizieren und zu verifizieren.

HTT is a protein involved in a plethora of cellular processes through its association with several interaction partners. Furthermore, a mutation in the HTT gene, causes a disease denominated Huntington’s disease (HD). Due to the scaffolding properties of HTT, a large variety of studies have been performed to identify potential therapeutical targets. However, resonance energy transfer-based (RET) approaches have not been fully exploited in the HD field. Therefore, I aimed to evaluate such approaches in interaction studies using the HTT exon 1 (HTTexon1) as well as the full-length protein. I performed a benchmarking study with a previously described huntingtin interacting protein (HIP) and HTTex1 (wild type and mutated) using a BRET approach. My studies confirmed the binary interaction between HTTex1 and seven proteins. I also confirmed three interactions with the mutated version of HTTex1. Additionally, I also evaluated the interactions by measuring FRET using flow cytometry. The second part of this work aimed to stablish a high-throughput screening for the detection of protein-protein interactions (PPIs) with full-length (FL) HTT using bioluminescence resonance energy transfer. With this, I was able to evaluate the interaction between FL HTT and a library composed by 580 protein kinases. Finally, I analysed the specificity of the detected interactions by assessing unspecific binding through donor saturation assays. In summary my results provide evidence of the potential use of resonance energy transfer approaches to validate HTT interactions. Additionally, a new screening tool is presented to contribute to identify and verify HTT interactors.